[發明專利]淋巴因子激活殺傷細胞LAK的激活方法

在審

• 申請號: 201810656000.5
• 申請日: 2018-06-23
• 公開（公告）號: CN108753721A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 何英廣;馬思航
• 申請（專利權）人: 淮安諾康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12P21/06;C07K1/34
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• 代理人: 暫無信息

本發明公開了淋巴因子激活殺傷細胞LAK的激活方法，將臍血單個核細胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基(10％FCS?RPMI 1640)調制至2×10⁶/mL，根據細胞總數接種于不同容量的培養容器中，同時加入終濃度為40?60μg/mL的酶解多肽A、酶解多肽C或酶解多肽D以及500IU/mL的rIL?2，置于37℃、5％CO₂條件下培養24h。本發明快速激活方法在不大量使用rIL?2的前提下，通過在培養基中添加酶解多肽A、酶解多肽C或酶解多肽D，僅使用24h即實現LAK細胞快速激活。

技術領域

本發明屬于生物領域，涉及一種淋巴因子激活殺傷細胞LAK的激活方法。

背景技術

免疫治療是新興的一種腫瘤治療方式，已經被列為繼手術、放療、化療后的第四種治療方式，在腫瘤的綜合治療中逐漸發揮重要作用。2010年，美國FDA批準世界上第一個細胞免疫治療產品Provenge上市，充分顯示出細胞免疫治療在腫瘤治療中的價值。

淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)是在20世紀80年代由Rosenberg等研發的，其實質是IL-2激活的具有殺瘤活性的NK和T細胞。1984年11月Rosenberg研究組經美國FDA批準，首次將LAK細胞用于臨床治療。該療法對轉移性腎細胞癌、黑色素瘤、結腸癌和非霍奇金淋巴瘤患者的療效較顯著。但LAK殺傷力不強，臨床應用需要大量輸注。而且其擴增能力有限，需要在輸注細胞的同時大劑量應用IL-2，從而導致明顯的毒副作用，最常見和最嚴重的毒副作用是毛細血管滲漏綜合征，主要表現為全身性水腫和多器官功能失調，可引起胸腹腔積液、肺間質水腫和充血性心力衰竭。

目前，LAK細胞要經過體外培養至少3～7天，流程長，費用昂貴，易污染，使臨床應用受到限制，故致力于簡便快捷誘導培養的研究從未停止過。

發明內容

本發明旨在克服現有技術不足，提供一種淋巴因子激活殺傷細胞LAK的快速激活方法。

本發明技術方案如下：

一種淋巴因子激活殺傷細胞LAK的快速激活方法，在培養基中添加rIL-2，在培養基中還添加激活劑酶解多肽A。

優選地，所述的快速激活方法具體步驟為：

將臍血單個核細胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基(10％FCS-RPMI 1640)調制至2×106/mL，根據細胞總數接種于不同容量的培養容器中，同時加入終濃度為40-60μg/mL的酶解多肽A以及500IU/mL的rIL-2，置于37℃、5％CO2條件下培養24h；

酶解多肽A的制備方法為：

將脫脂的小麥胚芽粉經木瓜蛋白酶+中性蛋白酶酶解，酶解結束后滅酶處理得到小麥胚芽的酶解液，冷卻后，離心，上清冷凍干燥得凍干粉。

將凍干粉用超純水溶解，然后依次用截留分子量為10000u、7000u的超濾膜對所得到的酶解液凍干粉進行分離，將超濾所得10000u～7000u組分冷凍干燥得到酶解多肽A。

優選地，酶解條件為：經木瓜蛋白酶(酶活力為80萬U/g)+中性蛋白酶(酶活力為20萬U/g)在復合配比3:1、pH為6.0、溫度55℃、底物質量濃度40g/L、加酶量5％(100g底物加5g酶)、酶解時間8h的條件下酶解。

優選地，酶解結束后升溫至90℃保持20min進行滅酶處理得到小麥胚芽的酶解液。

優選地，離心條件為：9000rpm離心25min。

優選地，采用聚蔗糖泛影葡胺分層液密度梯度離心法從臍血中分離臍血單個核細胞。