[發明專利]一種基于金屬釕配合物的實時熒光定量PCR檢測方法及試劑盒有效
| 申請號： | 201810653529.1 | 申請日： | 2018-06-22 |
| 公開（公告）號： | CN108753933B | 公開（公告）日： | 2021-07-23 |
| 發明（設計）人： | 徐秦峰;董菁;宋宏新;劉建蘭 | 申請（專利權）人： | 陜西科技大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 西安通大專利代理有限責任公司 61200 | 代理人： | 范巍 |
| 地址： | 710021 *** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 基于 金屬 配合 實時 熒光 定量 pcr 檢測 方法 試劑盒 | ||
1.一種基于金屬釕配合物的實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：該實時熒光定量PCR檢測方法包括以下步驟：
以金屬釕配合物作為實時熒光定量PCR反應體系中的染料組分；以拷貝數不同的多個核酸樣品作為標準品，將各標準品分別作為所述實時熒光定量PCR反應體系中的擴增模板組分，按預設的反應程序分別進行實時熒光定量PCR，反應結束后根據各標準品的循環閾值繪制標準曲線，線性濃度范圍達1×102copies/μL模板濃度；以未知拷貝數的核酸樣品作為所述實時熒光定量PCR反應體系中的擴增模板組分，按所述反應程序進行實時熒光定量PCR，根據所述標準曲線以及未知拷貝數的核酸樣品的循環閾值計算該樣品的DNA拷貝數；
所述金屬釕配合物為[Ru(phen)2(dppz)]2+或[Ru(bpy)2(dppz)]2+；
所述金屬釕配合物在反應體系中的終濃度為4-10μM；
實時熒光定量PCR采用三步法PCR反應程序，延伸階段利用一定的通道收集熒光信號：95℃預變性5min；95℃變性15s，57℃退火15s，68℃延伸30s并采集熒光信號，信號通道的激發和發射波長范圍分別為400-500 nm和550-750 nm，共30個循環；68℃再延伸5min，根據該信號獲得所述標準品或未知拷貝數的核酸樣品的循環閾值。
2.根據權利要求1所述一種基于金屬釕配合物的實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：所述核酸樣品為DNA或由提取的RNA反轉錄而成的DNA。
3.根據權利要求1所述一種基于金屬釕配合物的實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：所述實時熒光定量PCR檢測方法具體包括以下步驟：
1）設計引物
根據檢測目的及樣品的不同選取靶序列并設計引物；
2）配制反應體系，反應體系包括熱穩定DNA聚合酶、引物、dNTP、模板DNA以及所述金屬釕配合物；
3）實時熒光定量PCR
根據靶序列及引物的不同，確定擴增程序；以已知初始濃度的DNA樣品為模板，對模板進行預變性后按擴增程序循環反應并在循環反應的延伸步驟進行熒光信號收集，熒光信號的收集通道為：激發波長為400-500 nm，發射波長為550-750 nm；循環反應結束后再次進行延伸；然后根據收集的信號建立擴增曲線，由擴增曲線確定該DNA樣品的循環閾值；
4）重復步驟3），得到不同初始濃度的DNA樣品各自的循環閾值，結合對應DNA樣品的濃度建立標準曲線；
5）按照步驟3）對未知初始濃度的DNA樣品進行擴增，獲得相應的循環閾值并帶入步驟4）獲得的標準曲線中，從而計算得到該DNA樣品的初始濃度。
4.根據權利要求3所述一種基于金屬釕配合物的實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：所述未知初始濃度的DNA樣品利用試劑盒提取并純化得到。
5.根據權利要求1或3所述一種基于金屬釕配合物的實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：所述反應體系的終體積為10-20μL。
6.一種金屬釕配合物在實時熒光定量PCR檢測中的應用，其特征在于：以金屬釕配合物作為實時熒光定量PCR反應體系中的染料組分，所述金屬釕配合物在反應體系中的終濃度為4-10μM；所述金屬釕配合物為[Ru(phen)2(dppz)]2+或[Ru(bpy)2(dppz)]2+；
實時熒光定量PCR采用三步法PCR反應程序：95℃預變性5min；95℃變性15s，57℃退火15s，68℃延伸30s并采集熒光信號，信號通道的激發和發射波長范圍分別為400-500 nm和550-750 nm，共30個循環；68℃再延伸5min。
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