[發明專利]一種熱啟動Taq DNA聚合酶的制備方法

在審

• 申請號: 201810651498.6
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108949716A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 鄭春楊;劉金朝;申奧;張國林
• 申請（專利權）人: 青島中科愛博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 青島華慧澤專利代理事務所(普通合伙) 37247
• 代理人: 馬千會

本發明公開一種熱啟動TaqDNA聚合酶的制備方法，包括以下步驟：(1)將純化的TaqDNA聚合酶作為底物包被，利用噬菌體展示技術進行三輪的淘選流程，得到富集的同底物具有高親和力的陽性備選配體；(2)分析富集的陽性備選配體序列組成，同底物結構比對后，選擇若干可以與之結合的陽性克隆，利用大腸桿菌體外表達系統表達得到系列陽性配體；(3)將體外表達得到的配體、TaqDNA和多克隆抗體按照3：3：1的比例混合后得到熱啟動TaqDNA聚合酶。本發明制備的熱啟動TaqDNA聚合酶，能夠在最大限度保持酶活性的基礎上常溫更好的封閉酶的活性，在分子診斷多個平臺上驗證其使用效果優于傳統的熱啟動TaqDNA聚合酶。

技術領域

本發明涉及生物學技術領域具體涉及一種熱啟動Taq DNA聚合酶及其制備方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應技術(PCR反應)是現代生物技術的核心技術之一，該技術的原理為利用Taq DNA聚合酶在體外利用與目的模板特異結合的上下游引物，通過95℃變性、60℃退火、72℃延伸三個步驟經過25-40個循環達到對目的基因片段的大量擴增。該技術經過近40年的發展，已經廣泛的應用于生物科學科研和醫學檢測中。

隨著檢測技術的發展和需求的提高，PCR技術已經由之前的定性分析發展到了定量分析。通過實時熒光定量技術，檢測人員可以實現對樣品中的較低的病毒數量進行檢測分析，為醫生提供更為早期的診斷依據。而傳統的Taq DNA聚合酶由于其在常溫下具備一定的活性，從而容易造成引物二聚體和非特異擴增，進而造成檢測結果的偏離甚至產生假陽性的結果。

針對這一應用需求開發出了熱啟動技術，其核心機制在于抑制Taq DNA聚合酶常溫下的活性反應。目前常見的熱啟動技術分為：1石蠟包埋法；2抗體抑制法；3化學修飾法等：

1、石蠟包埋法的原理是將Taq DNA聚合酶包埋于石蠟小球中，常溫下酶同反應體系隔絕，加熱后石蠟融化釋放酶參加反應。但石蠟球制備復雜，且石蠟對于熒光讀取有一定干擾，使用受到很大限制。

2、抗體抑制法使用傳統單克隆抗體，低溫抗體同酶結合抑制活性，高溫抗體失活釋放活性。本方法為目前主流方法之一。但抗體抑制法的問題在于：a.傳統的單克隆抗體制備方式無法在制備階段特異性的針對酶的活性位點進行制備，所以對于酶的抑制效果有限，即對于擴增反應中無模板對照組(NTC)的抑制效果有限，無法滿足高特異性應用的需求。b.單克隆抗體制備成本較高，且抗體批次穩定性較差也限制了其大規模的應用。

3、化學修飾法使用生化試劑對特定氨基酸進行修飾，進而達到抑制活性的作用?；瘜W修飾法成本較抗體抑制法低，也是主流熱封閉技術。但化學封閉技術容易造成Taq DNA聚合酶結構的不可逆損傷，進而影響活化后酶的靈敏度，不適用于一些對檢測靈敏度高的應用。而且由于化學修飾的自身的穩定性，導致打開化學鍵釋放酶活性的過程需要大量的能量，體現在反應中則需要95℃更長的時間。已ABI公司的金牌熱啟動Taq酶來說激活過程長達10-15min。大大增加了反應時間，增加了反應的不確定性。

總體來說，熱啟動技術的重點集中在不損失酶活性的基礎上的常溫活性控制。化學修飾由于其“無差別”封閉的特點會造成活性的損失，漸漸的不能適應更高的檢測要求。而傳統的單克隆抗體由于缺少有效的檢測方法，很難篩選到正好能針對活性位點結合的抗體株。同時酶的活性是由多個活性區域決定的，單一抗體很難滿足需求。

發明內容

本發明的目的是提供一種由噬菌體體外展示篩選得到特異性系列配體配合多克隆抗體的熱啟動Taq DNA聚合酶的制備方法，彌補市面上常規的抗體抑制法和化學修飾法制備出的熱啟動Taq DNA聚合酶存在的缺點，為分子診斷和科研提供特異性更好、擴增效率更高的熱啟動Taq DNA聚合酶。

為了實現上述目的，克服現有技術存在的不足，本發明采用以下技術方案：一種熱啟動Taq DNA聚合酶的制備方法，具體步驟如下所述：