[發明專利]一種用于檢測金黃色葡萄球菌活性的熒光RAA引物、探針及檢測方法

在審

• 申請號: 201810646201.7
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN108531633A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 周冬根;羅潔;應清界;俞雪鈞
• 申請（專利權）人: 寧波國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/14;C12N15/11;C12R1/445
• 代理公司: 廈門福貝知識產權代理事務所(普通合伙) 35235
• 代理人: 郝學江

本發明提供了一種用于檢測糞便樣品中金黃色葡萄球菌活性的熒光RAA引物和探針及檢測方法，該熒光RAA引物和熒光探針可以快速、定性檢測糞便樣本中的金黃色葡萄球菌活性，能在39℃常溫下檢測，20分鐘內即可出診斷結果，大大縮短檢測時間；該熒光RAA引物和熒光探針特異性更強、靈敏度更高，完全滿足疫情快速診斷和全程監控，為疫情早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間。

技術領域

本發明屬于體外核酸檢測領域，具體涉及一種用于檢測糞便樣品中金黃色葡萄球菌活性的熒光RAA引物和探針及檢測方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一，在自然界中廣泛存在，尤其是肉及肉制品、乳及乳制品等主要的食品類別中，屬于革蘭氏陽性菌，直徑為0.8～1.5微米，無鞭毛、芽孢，少數有莢膜，不能運動，為需氧或兼性厭氧菌。最適宜的生長溫度為37℃，pH值為7.4。金黃色葡萄球菌具有高度的耐鹽性，可以分解乳糖、麥芽糖、蔗糖、核糖、松二糖、甘露糖產酸不產氣，在1884年首次被發現，Rosenbach在固體培養基上培養出葡萄球菌，并在同年記錄了它能引起食物中毒。

金黃色葡萄球菌自身細胞膜相對致密，存活率相對較高，同時，產生的金黃色葡萄球菌腸毒素種類繁多、致病性強，且易溶于水、鹽溶液，能夠耐受胃液中的蛋白酶，100℃30min內仍可存活。有資料報道，在每100g食物中含有不足18μg的腸毒素便能引起金黃色葡萄球菌中毒癥狀。該腸毒素是由血漿凝固酶或耐熱酸酶陽性菌株所產生的一類結構相關、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質，經過血清學鑒定包括14種，常見的有SEA、SEB、SEC、SED、SEE。同時金黃色葡萄球菌還能產生α、β、γ、δ四種溶血毒素，這些溶血毒素可以導致血小板和溶酶體損傷，有的毒素還可以導致白細胞和巨噬細胞的損壞，有的可以導致血液中纖維蛋白的沉積。其分泌的葡萄球菌腸毒素可引起人類胃腸炎性等多種疾病。據報道，每100克食物中含18微克葡萄球菌腸毒素時即可引起金黃色葡萄球菌食物中毒。根據美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。

傳統的檢測方法檢測周期長，且分離陽性率低，往往會延誤病程和疫情的控制。分子生物學診斷方法可以在癥狀時期檢測到細菌的感染，并且快速靈敏，目前已被廣泛的應用于金黃色葡萄球菌的檢測。目前，國內外已建立的金黃色葡萄球菌檢測方法有實時PCR檢測方法、半巢式PCR檢測方法、LAMP檢測方法等，但PCR方法需要使用復雜的儀器和裝備精良的實驗室，而LAMP方法引物較復雜，必須用特殊的軟件設計，且用LAMP方法得到的擴增產物是一些大小不等的片段，無法直接克隆和測序，只能用于判斷目的基因的存在。

發明內容

本發明目的是提供一種用于重組酶介導核酸擴增技術檢測金黃色葡萄球菌活性的熒光RAA引物和熒光探針以及使用該熒光RAA引物和熒光探針對金黃色葡萄球菌活性的檢測方法，該檢測方法可以快速、定性檢測糞便樣本中的金黃色葡萄球菌活性。

本發明的一個目的是提供一種用于檢測金黃色葡萄球菌的引物對，所述引物對包括下述1)-3)中的至少一種：

1)序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；

2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №：1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；和在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №：2限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；

3)與1)、或2)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具體的，所述同源性為95％以上；再具體的為96％以上；再具體的為97％以上；再具體的為98％以上；再具體的為99％以上。

上述高嚴謹條件可為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。