[發明專利]檢測雙酚B的膠體金免疫層析檢測卡及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201810635223.3
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108845131B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 劉香梅;劉穎;龐增雄;黃金鳳;郭燕華;郭新東;陳立偉;冼燕萍;侯向昶;吳玉鑾
• 申請（專利權）人: 廣州質量監督檢測研究院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/68;G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 廣州海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王洪娟

1.一種檢測雙酚B的膠體金免疫層析檢測卡，其特征在于，所述檢測卡上設有順次搭接粘貼在底板上的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；

所述膠體金結合墊上吸附有膠體金標記的抗雙酚B單克隆抗體；

所述硝酸纖維素膜上由樣品墊端至吸水墊端依次設有檢測線與質控線，所述檢測線包被有雙酚B-載體蛋白偶聯物，所述質控線包被有抗鼠二抗：

所述雙酚B-載體蛋白偶聯物通過以下方法制備得到：將0.24g雙酚B、0.15g 3-溴丙胺、0.70g無水碳酸鉀分散至20mL干燥丙酮中，加熱回流反應8h，制得雙酚B半抗原，將純化后的雙酚B半抗原、N-羥基丁二酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽加于燒杯中，加入3mL二甲基亞砜溶解，磁力攪拌過夜，然后稱取0.12g載體蛋白，溶解在5mLpH7.0的0.1mol/LNaHCO₃中，得載體蛋白溶液，將含有雙酚B半抗原的溶液加入上述載體蛋白溶液中，邊攪拌邊緩慢滴加，反應過夜，所得溶液4℃透析3天，即得；

所述抗雙酚B單克隆抗體通過以下方法制備得到：

(A)動物免疫：取上述雙酚B-載體蛋白偶聯物，與弗氏完全佐劑乳化完全后，免疫6-8周齡的雌性Balb/C小鼠，免疫后斷尾取血測定效價，選擇結果最佳的小鼠準備融合；

(B)細胞融合：取經選定小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞進行融合，以HAT培養基篩選融合的細胞，用間接ELISA法測定上清液進行陽性篩選，篩選出穩定分泌抗雙酚B的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

(C)抗體制備：取雜交瘤細胞株在體外常規培養、傳代后，注射入Balb/C小鼠腹腔，抽取腹水，通過辛酸-硫酸銨沉淀純化腹水，并以親和層析法得到純化的抗雙酚B-單克隆抗體；

所述膠體金標記的抗雙酚B單克隆抗體通過以下方法制備得到：

(A)膠體金溶液制備：在水中加入檸檬酸三鈉，煮沸后加入氯金酸，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色變為透明的紫紅色后停止加熱，補水至原體積，冷卻，保存備用；

(B)膠體金標記物的制備：取已制備好的膠體金溶液40mL，用0.1mol/L K₂CO₃調節膠體金溶液pH至8.2；取等量抗雙酚B單克隆抗體溶液，磁力攪拌下與膠體金溶液混合，室溫孵育15min，10000r/min離心30min，棄上清；將所得沉淀用含2％BSA、0.1％疊氮鈉的pH7.4的PBS緩沖液溶解稀釋，即獲得膠體金標記的抗雙酚B單克隆抗體；

所述膠體金標記的抗雙酚B單克隆抗體的濃度為40-80μg/ml，在檢測卡上的用量為4-6μL/cm；

所述檢測線包被的雙酚B-載體蛋白偶聯物的濃度為0.1-0.3μg/ml，在檢測卡上的用量為0.5-1.5μL/cm；

所述質控線包被的抗鼠二抗的濃度為0.1-0.3mg/ml，在檢測卡上的用量為0.5-1.5μL/cm。

2.根據權利要求1所述的檢測雙酚B的膠體金免疫層析檢測卡，其特征在于，所述檢測卡樣品墊端和吸水墊端還分別設有樣品端保護膜和手柄端保護膜，所述樣品端保護膜覆蓋樣品墊、膠體金結合墊、以及硝酸纖維素膜與所述膠體金結合墊搭接端，所述手柄端保護膜覆蓋吸水墊、以及硝酸纖維素膜與所述吸水墊搭接端。

3.根據權利要求2所述的檢測雙酚B的膠體金免疫層析檢測卡，其特征在于，所述底板為PVC條；

所述樣品墊和膠體金結合墊由玻璃纖維棉制成；

所述吸水墊由吸水濾紙制成；

所述保護膜為不透明的膠膜。

4.根據權利要求1所述的檢測雙酚B的膠體金免疫層析檢測卡，其特征在于，所述載體蛋白為牛血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白；所述抗鼠二抗為羊抗鼠IgG抗體、兔抗鼠IgG抗體或驢抗鼠IgG抗體。