[發明專利]一種乙醇脫氫酶突變體及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201810634866.6
• 申請日: 2018-06-15
• 公開（公告）號: CN108753745B
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 陳本順;常斌;陳峻青;武濤;石利平;徐春濤;劉靖;朱偉偉;楊瑩;陳曉佩
• 申請（專利權）人: 宿遷阿爾法科技有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 32288 南京思拓知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 呂鵬濤

本發明公開了一種乙醇脫氫酶突變體及其編碼基因和應用。一種高活性的乙醇脫氫酶突變體基因，編碼序列為SEQ ID NO.2，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。一種將該基因導入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)獲得含有該基因的工程菌株，包括該基因制備方法以及發酵培養、收集方法，實現乙醇脫氫酶突變體的制備。本發明提供一種催化活性高、pH及熱穩定性、耐受性較好的乙醇脫氫酶突變體，可用于輔酶NADH以及NADPH的再生。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種乙醇脫氫酶突變體及其編碼基因和應用。

背景技術

生物催化技術是一種以微生物細胞或酶作為催化劑進行物質轉化的技術。它具有條件溫和、副反應少、選擇性強、能耗低以及對環境友好等優點，已經取得了顯著的成就。尤其是在綠色化學和醫藥領域引起了廣泛的關注。其中酶作為一種常見的生物催化劑，在生物催化過程中具有具足輕重的作用。

氧化還原反應是重要的一類化學反應。氧化還原酶是這類催化反應的重要的生物催化劑，但是通常需要輔酶來完成酶催化反應中的電子轉移，而輔酶價格昂貴。因此輔酶的有效再生成為氧化還原酶工業應用的關鍵。構建經濟高效的輔酶再生體系來實現輔酶的再生，既可解決工業中輔酶價格昂貴的難題，也為氧化還原酶的工業應用打下良好的基礎，符合當前國民經濟要求綠色低碳的趨勢。

乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase，簡稱ADH)的系統名為:乙醇:輔酶I氧化還原酶(alcohol:NAD+oxidoreductase)，大量存在于人和動物肝臟、植物及微生物細胞之中，是一種含鋅金屬酶，具有廣泛的底物特異性。乙醇脫氫酶夠以NAD(P)⁺為輔酶,催化伯醇和醛之間的可逆反應:CH₃CH₂OH+NAD(P)⁺→CH₃CHO+NAD(P)H+H⁺。

發明內容

本發明的目的是提供一種催化活性高乙醇脫氫酶突變體，制備方法和應用。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

本發明提供一種乙醇脫氫酶突變體基因，其來源為乳酸菌Lactobacillus野生型基因SEQ ID NO.1。“野生型”是指在自然界發現的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物體中的序列，能夠從自然界來源中分離并且沒有被人為操作有意修飾。

本發明提供一種乙醇脫氫酶突變體，其脫氫酶活性是野生型乙醇脫氫酶活性2-2000倍。

上述乙醇脫氫酶突變體，根據密碼子優化、重疊延伸PCR、重組PCR、大引物PCR和環狀質粒PCR等方法對其進行突變，從而獲得該乙醇脫氫酶突變體目的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2。

一種乙醇脫氫酶突變體，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明提供一種乙醇脫氫酶突變體基因的重組質粒，其可通過本領域常規方法將本發明的乙醇脫氫酶基因的核苷酸序列連接于各種原核表達載體上構建而成。如pGEX，pMAL，pET系列等原核表達載體，更優選地選自pET系列。本發明的一個實施例中所使用的質粒為pET-30a(SEQ ID NO.6)。

本發明提供一種生產所述的乙醇脫氫酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本發明所述的乙醇脫氫酶突變體基因或本發明所述的重組載體。

上述基因工程菌的宿主細胞優選為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

本發明提供一種制備所述的乙醇脫氫酶突變體的方法，包括發酵培養該基因工程菌，以及收集和制備重組乙醇脫氫酶。