[發(fā)明專利]一種鈉離子切割型通用隔斷超快擴增可視化傳感器

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810634838.4
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108841935B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設計）人: 許文濤;羅云波;黃昆侖;杜再慧;田晶晶
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

1.鈉離子檢測方法，其特征在于，包括：

1)核酶的構建：將底物鏈與酶鏈按等摩爾比例混合，用緩沖液稀釋至濃度1-2μM，85-95℃加熱15min，然后緩慢降至25-37℃，即得核酶液；

2)切割反應：向35μL上述核酶液中加入待測樣品溶液，形成40μL體系，于36-38℃孵育6min，然后加入4-6μL終止液，得到切割產(chǎn)物；

3)超速PCR反應：配制由正向隔斷引物、切割產(chǎn)物、模板、DNA聚合酶、dNTP、反應緩沖液和ddH₂O組成的PCR反應體系，設置如下反應程序：90-95℃ 2s，55-60℃ 3s，30-40個循環(huán)，進行PCR反應，得到PCR產(chǎn)物；

4)HCR反應：構建由探針1、探針2、PCR產(chǎn)物和自組裝緩沖液組成的HCR反應體系，于37℃反應30-60min，得到HCR產(chǎn)物；

5)顯色反應：將80μL酶活緩沖液、10μL氯高鐵血紅素溶液與10μL HCR產(chǎn)物混合，于37℃反應30min，使HCR產(chǎn)物結(jié)合氯高鐵血紅素形成具有類過氧化物酶活性的G四鏈體結(jié)構，加入100μL ABTS顯色液，混勻，37℃避光孵育5-10min，根據(jù)加入顯色液前后溶液顏色的變化或利用酶標儀測定溶液的OD值變化，來判斷待測樣品中是否含有鈉離子以及鈉離子濃度的高低；

其中，步驟1)所述緩沖液的配方為：50mM MES,pH 6.0，25mM LiCl；

步驟2)所述終止液的配方為：0.2M EDTA，2M NaCl,0.5M Tris；

步驟4)所述自組裝緩沖液的配方為：8mM Na₂HPO₄,2.5mM NaH₂PO₄,0.15M NaCl,2mMMgCl₂,pH 7.4；

步驟5)所述酶活緩沖液的配方為：100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl₂、100mM KCl，pH8.4；

步驟5)所述氯高鐵血紅素溶液的配制方法為：用DMSO配制濃度為20mM的氯高鐵血紅素原液，將2μL氯高鐵血紅素原液與1mL所述酶活緩沖液混合，即得；

步驟3)中PCR反應體系如下：模板0.01-0.02μM，DNA聚合酶1.5-2U/mL，正向隔斷引物2μM，切割產(chǎn)物2-3μL，dNTP 250μM，1×反應緩沖液，ddH₂O補齊至10μL；

步驟4)中HCR反應體系的構建方法如下：

①將探針1、探針2分別用水溶解至100μM，于90-95℃加熱5min，然后緩慢降至室溫備用；

②將PCR產(chǎn)物加入終濃度為2-3μM的探針1和探針2的混合液中，并加入自組裝緩沖液至總體積50μL；

鈉離子檢測中所用的底物鏈、酶鏈、正向隔斷引物、切割產(chǎn)物、模板和兩條探針的堿基序列如下：

底物鏈：5′-CTCTATCTATrA-GGAAGTACCGCCGCGGAGGGA-3′

酶鏈：5′-GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG-3′

正向隔斷引物：5′-AGACGAAGCACTGGTTGAAACTCC-聚六乙二醇-GGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′

切割產(chǎn)物：5′-GGAAGTACCGCCGCGGAGGGA-3′

模板：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCTCCCTCCGCGGCGGTACTTCC-3′

探針1：5′-AGGGCGGGTGGGTGGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTCCCCAGACGAAGCACTGGTTGATGGGT-3′

探針2：5′-TGGGTAGACGAAGCACTGGTTGAAACTCCTCAACCAGTGCTTCGTCTGGGGTGGGTAGGGCGGG-3′

其中，rA表示核糖核酸；-表示鈉離子切割位點。