[發明專利]一種量子點納米球標記的熒光免疫印跡檢測方法

在審

• 申請號: 201810632339.1
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108663345A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 上海昆道生物技術有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/532;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用量子點納米球標記的熒光免疫印跡檢測蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟：首先將待測蛋白混合物進行凝膠電泳分離，電泳后的凝膠進行western blot電轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，然后對蛋白轉移后的膜進行封閉，加目標蛋白特異性的一抗孵育反應，再加入一抗種屬特異性的二抗標記的量子點納米球進行孵育反應，最后將膜在激發光源照射下成像拍照。

2.根據權利要求1所述的量子點納米球標記的免疫印跡檢測蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟：

（一）量子點納米球標記抗體的制備

（1）利用微乳液溶劑揮法制備量子點-聚合物復合納米球；

A、油相組分：將量子點和聚合物分散在氯仿溶液中，量子點的濃度為0.1～5微摩爾每升，聚合物的濃度為0.05～5.0 mg/mL；

B、水相組分：將聚乙烯醇和十二烷基磺酸鈉配置成水溶液，其中聚乙烯醇的濃度為0.01～2.5%，十二烷基磺酸鈉的濃度為0.1～0.5%；

C、4℃水浴中，磁力攪拌下，將油相溶液加入水相溶液中，持續攪拌10～60分鐘，然后使用超聲破碎儀將混合液進行超聲處理1～10分鐘，即得到均勻穩定的微乳液；

D、室溫下，將微乳液置于敞口容器，磁力攪拌下，使溶劑逐漸揮發，揮發時間為6～48小時，離心洗滌，干燥得到量子點納米球；

（2）將二抗共價偶聯在量子點納米球表面

A、量子點納米球分散在pH 4.0～6.0的磷酸鹽緩沖液中，納米球濃度0.5～5mg/mL，然后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）和N-羥基硫代琥珀酸亞胺（sulfo-NHS），濃度0.1～1.0 mmol/L，二者摩爾比為1/1，室溫下孵育30分鐘；

B、向活化后的納米球溶液中加入抗體，抗體的濃度為50～500 μg/mL，然后室溫下孵育1小時后，加入牛血清白蛋白，濃度為1～10 mg/mL，繼續室溫下孵育2h；

C、得到的反應產物，在5000～20000轉每分的轉速下，離心0.5～2小時，棄去離心上清后，將沉淀分散在磷酸鹽緩沖液中，即得到量子點納米球免疫熒光二抗；

（二）免疫印跡分析目標蛋白

（1）SDS聚丙烯酸按凝膠（SDS-PAGE）電泳

根據待測目標蛋白的分子量選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，混合蛋白上樣后，在恒壓條件下進行電泳；

（2）Western blot轉移蛋白

分離后的蛋白電泳凝膠去除濃縮膠部分，平鋪在經過浸泡處理的NC膜或者PVDF膜上，按3層濾紙、凝膠、NC膜或PVDF膜、3層濾紙疊放，置于半干式電轉儀上，恒流轉膜；

（3）免疫檢測

將轉好的膜用TBST緩沖液清洗后，置于封閉液中孵育封閉，之后用目標蛋白特異性的一抗孵育，然后TBST洗滌兩次，加入1:500-5000稀釋的量子點納米球球標記二抗，室溫孵育0.5-2 h，再用TBST洗滌3次；

洗滌后的膜在紫外光源照射下，即得到熒光免疫印跡圖像。