[發明專利]一種陸地棉逆境誘導啟動子pGhWRKR2的克隆及其應用

在審

• 申請號: 201810631879.8
• 申請日: 2018-06-19
• 公開（公告）號: CN108866055A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 司愛君;呂寧;陳兵;田琴;陳紅;劉麗;余渝;林海;孔憲輝;王旭文
• 申請（專利權）人: 新疆農墾科學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 烏魯木齊恒智專利商標代理事務所(普通合伙) 65102
• 代理人: 李靖

本發明公開了一種陸地棉逆境誘導啟動子pGhWRKR2。本發明還公開了所述啟動子在植物抗逆基因研究中的應用，通過構建該啟動子驅動GUS的植物表達載體pGhWRKR2∷GUS，并經農桿菌花絮侵染法轉化擬南芥，對轉基因擬南芥進行GUS染色觀察。結果表明，pGhWRKR2啟動子主要受干旱脅迫誘導表達，并且在逆境條件下通過各區域調控元件的共同作用參與干早肋迫應答反應。陸地棉pGhWRKR2啟動子的研究為外源基因在棉花逆境中的有效表達奠定基礎，在抗旱、抗高滲脅迫等抗逆特性的轉基因植物優良品種選育等方面具有很大潛力，在棉花抗逆轉基因研究中將會得到廣泛的應用。

技術領域

本發明涉及生物技術和植物基因工程技術領域，確切地說是棉花逆境誘導啟動子pGhWRKR2的克隆及其在轉基因植物中的應用。

背景技術

棉花在整個生育期內不可避免會受到多種不良環境變化的影響，如干旱、高鹽、低溫等。由于植物抗逆性狀本身的復雜性及其與數量性狀位點連鎖關系的復雜性，用傳統的育種方法提高植物的抗逆性十分困難。在逆境脅迫下，植物能感知并傳遞脅迫信號，通過激活相應轉錄因子，啟動抗逆功能基因的表達，使植物體內發生一系列的生理生化反應抵御不良環境的危害，從而提高植物的耐逆性。這些受環境影響而誘導表達的基因都是由誘導啟動子調控其轉錄的，分離和研究這些基因的調控區域對于研究植物響應各種脅迫的生理機制以及研究農作物的抗逆基因工程無疑具有重要意義。誘導型啟動子的啟用，相當于在轉基因的上游設置一個有效的“表達開關”，接受外界環境或誘導物質等因子的調控。當轉基因植物受到逆境脅迫時就會表達相應蛋白，從而使轉基因植物更好地適應逆境。因此，分離逆境脅迫誘導高效表達的啟動子是解決植物抗逆基因工程的關鍵因素。

在以往的植物基因工程研究中，組成型啟動子由于簡單方便而得到廣泛應用。組成型啟動子驅動外源基因在棉花的不同時期和不同部位均能表達，而且組成型啟動子的高表達、強啟動效應容易積累大量異源蛋白或代謝產物，從而影響棉花正常生長。逆境脅迫誘導型啟動子能驅動外源基因在植物處于逆境脅迫條件下(干早、高鹽及低溫等)特異表達，而不影響植物生長發育及生理代謝。因此，在植物的基因工程領域中，亟待獲得有效的誘導表達啟動子，使靶標基因精確地按需表達，從而為農業生產服務。國內外已有很多學者從事這方面的研究，并且有不少成功的例子。GhWRKY64(KF031101)基因上游啟動子的表達不僅具有組織特異性，并且為病原菌所誘導。水稻干旱脅迫誘導啟動子Oshox24P受脫落酸(ABA)的誘導，但對高鹽和低溫脅迫的反應并不明顯。茄線粒體小分子熱激蛋白(Lehsp23.8)的啟動子融合GUS轉化煙草，可鑒定其組織表達特異性及順式表達元件。葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的上游啟動子PCAN具有低溫和干旱脅迫誘導表達特性。擬南芥低溫誘導cor15a基因的啟動子轉化馬鈴薯(Solanum tuberosum)具有低溫誘導表達的能力。馬鈴薯低溫誘導啟動子(CIP)抑制馬鈴薯塊莖發生低溫糖化。魯棉研GhSNAC3啟動子是一個鹽誘導型啟動子，且具有組織特異性。水稻OsGSTLc上游啟動子的不同啟動子缺失系列均能啟動下游GUS報告基因的表達。擬南芥冷誘導型啟動子CBF3和農桿菌Ti質粒上的IPT基因使得轉基因植株性狀發生了很大的改變。木薯低溫干旱誘導基因MeLTI6A的啟動子可能通過對干旱脅迫激素信號響應以及逆境脅迫響應起作用。擬南芥AtPUB18的啟動子驅動報告基因GUS的.組織化學染色結果表明，AtPUB18的表達受高鹽脅迫誘導。小麥逆境誘導表達啟動子mwcs120在單子葉和雙子葉植物中均受低溫和高鹽逆境誘導表達。低溫誘導GmERF9P啟動子在低溫處理下能夠提高GUS基因的表達量,具有低溫誘導啟動活性。大麥啟動子HVA1s、Dhn4s和Dhn8s可有效啟動GFP和GUS基因在大麥幼苗中的瞬間表達。綜上所述，在不少植物中發現了誘導型啟動子，但關于棉花逆境誘導表達啟動子的研究，有關的報道相對較少。棉花逆境誘導啟動子能驅動外源基因在轉基因植物中適時表達，不但可以降低植物耗能減輕對植物形態和生長發育的影響，還可以提高外源基因在特定時刻的表達濃度，增強轉基因的效果，有目的地改良棉花的品質和產量。因此，分離、克隆脅迫誘導型啟動子對于研究在轉錄水平上抗逆相關基因的上游表達調控機制具有重要意義。