[發(fā)明專利]一種體外活化小鼠T淋巴細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810631726.3
• 申請日: 2018-06-19
• 公開（公告）號: CN108841789A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊加彩;劉美希;王旭;李傳貴;宋亞軍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 重慶鼎慧峰合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50236
• 代理人: 周維鋒

1.一種體外活化小鼠T淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

A.獲取小鼠脾臟、外周淋巴結(jié)、粘膜上皮或外周血的淋巴細(xì)胞；

B.選出CD3ε+淋巴細(xì)胞，并檢測其純度；

C.用具有生物活性的抗小鼠CD3ε和CD28兩種抗體包被48孔細(xì)胞培養(yǎng)板；

D.將步驟C所得的細(xì)胞培養(yǎng)板中加入活化T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

E.將步驟D所得細(xì)胞板在CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12小時(shí)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化小鼠T淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟A中小鼠脾臟、外周淋巴結(jié)或粘膜上皮的獲取與處理的方法為：將6～10周齡的清潔級小鼠，斷頸處死，用體積分?jǐn)?shù)為70～85％的酒精溶液浸泡3～10分鐘；無菌取出脾臟、外周淋巴結(jié)或粘膜上皮，將其置于直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，所述培養(yǎng)皿中包括18mL磷酸鹽緩沖液和2mL胎牛血清。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化小鼠T淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟B中選用磁珠法篩選CD3ε+淋巴細(xì)胞，所述檢測為流式細(xì)胞檢測法。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化小鼠T淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟C中用于包被48孔細(xì)胞培養(yǎng)板所用的抗小鼠CD3ε和CD28兩種抗體混合液的濃度分別為10μg/mL和2μg/mL，用pH值為7.6的磷酸鹽緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用，配制好后每孔加入100μL抗體混合液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的活化小鼠T淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，所述抗小鼠CD3ε和CD28兩種抗體混合液包被48孔細(xì)胞培養(yǎng)板后蓋上培養(yǎng)板蓋子，晃動培養(yǎng)板，使抗體混合液均勻覆蓋培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)底部。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化小鼠T淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟D中細(xì)胞接種的48孔板，接種的細(xì)胞懸液的濃度為1*10⁶/mL，每孔接種500μL細(xì)胞懸液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化小鼠T淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟D中活化T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基以RPMI-1640為基礎(chǔ)，添加如下成分，以達(dá)到如下濃度：體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清，1*10⁴μmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，20μmol/L的L-谷氨酰胺，10μmol/L的丙酮酸鈉，1μmol/L的非必需氨基酸溶液，50μmol/L的β-巰基乙醇和1*10⁵單位/L的重組小鼠白介素-2蛋白。