[發明專利]基于化學標記和質譜的蛋白與材料相互作用結構分析方法

在審

• 申請號: 201810622200.9
• 申請日: 2018-06-15
• 公開（公告）號: CN110609103A
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發明（設計）人: 王方軍;賀敏
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88;G01N30/72
• 代理公司: 21002 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 馬馳

1.基于化學標記和質譜的蛋白與材料相互作用結構分析方法，其特征為：首先對蛋白質和蛋白質與材料孵育后形成的蛋白質-材料復合物分別進行化學標記，隨后進行蛋白質的變性、酶解、色譜-質譜聯用分析和數據庫檢索，對比材料加入前后蛋白質上所有特定氨基酸位點的化學標記效率變化情況，標記效率明顯下降的氨基酸所在區域即為蛋白質-材料相互作用區域，標記效率明顯上升的氨基酸所在區域即為蛋白質在結合材料后構象變化區域。

2.根據權利要求1所述的分析方法，其特征為：在材料加入前后分別進行活性條件下蛋白質伯胺基團二甲基化反應，在標記過程中不影響蛋白質的結構、活性以及與材料的相互作用情況；

標記試劑為甲醛(CH₂O)或氘帶甲醛(CD₂O)或¹³C氘帶甲醛(¹³CD₂O)；中的一種或二種以上；標記過程采用的催化劑為氰基硼氫化鈉(NaBH₃CN)和氘代氰基硼氫化鈉(NaBD₃CN)中的一種或二種；

所述特定氨基酸為賴氨酸。

3.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于：無機材料包括但不限制于金納米顆粒、氧化鐵、氧化鎢、二氧化硅、二氧化鈦、石墨烯、沸石等無機或復合材料中的一種或二種以上；

所述標記效率為質譜鑒定到的標記形式肽段的譜圖數或對應標記形式肽段的質譜檢測峰面積與質譜鑒定到的相應標記和非標記形式肽段的總譜圖數或對應標記和非標記形式肽段的質譜檢測峰總面積之比值；

所述明顯下降是指某一氨基酸位點在蛋白質-材料復合物組中的標記效率比蛋白質組中的標記效率下降10％以上；

所述明顯上升是指某一氨基酸位點在蛋白質-材料復合物組中的標記效率比蛋白質組中的標記效率上升10％以上。

4.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于：

所述的蛋白酶包括但不限制于胰蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解酶中的一種或二種以上；

所述的色譜-質譜聯用是色譜和質譜聯用技術，先用色譜對肽段進行分離，再用質譜進行檢測。

5.根據權利要求1-4任一所述的分析方法，其特征在于：

包括以下步驟：

1)取相同質量的蛋白質樣品分成兩組并溶于pH 2.0-10.0的HEPES、TEAB或PB溶液中，蛋白質濃度為0.01-50μg/μL,加入材料的一組為實驗組，另一組則為對照組，蛋白質和材料的質量比為1:1-1:1000；

2)將上述步驟1)得到的兩組蛋白質溶液在4-40℃下同時進行孵育，孵育時間為2-200min；

3)向上述步驟2)得到的兩組溶液中分別加入終濃度均為0.01-100mmol/L的甲醛(CH₂O)或氘帶甲醛(CD₂O)或¹³C氘帶甲醛(¹³CD₂O)中的一種或二種以上和0.01-100mmol/L的氰基硼氫化鈉(NaBH₃CN)或氘帶氰基硼氫化鈉(NaBD₃CN)中的一種或二種，反應溫度為4-40℃，反應時間為5-120min；

4)向上述步驟3)得到的兩組溶液中分別加入與甲醛(或氘帶甲醛或¹³C氘帶甲醛中的一種或二種以上)摩爾濃度比為10:1-100:1的醋酸銨(CH₃COONH₄)或碳酸氫銨(NH₄HCO₃)中的一種或二種；

5)向上述步驟4)得到的兩組溶液中分別加入變性劑，煮沸，加入蛋白酶，20-40℃酶解；

6)對上述步驟5)得到的兩組肽段溶液進行酸化處理，將對照組溶液和實驗組的上清溶液進行色譜分離和質譜檢測。