[發明專利]人源化CD28基因改造動物模型的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201810621710.4
• 申請日: 2018-06-15
• 公開（公告）號: CN109136261B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 沈月雷;白陽;郭雅南;張美玲;黃蕤;尚誠彰;姚佳維
• 申請（專利權）人: 百奧賽圖（北京）醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N15/90;C12N5/10;C12N15/62;C12N15/12;C07K19/00;A01K67/027
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

1.一種人源化小鼠動物模型構建的方法，其特征在于，所述人源化小鼠動物模型基因組中包括嵌合CD28基因，所述的嵌合CD28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示，該人源化小鼠動物模型體內可表達人源化CD28蛋白，同時內源CD28的蛋白表達降低或缺失。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合CD28基因編碼人源化CD28蛋白，所述人源化CD28蛋白的組成包括胞外區、跨膜區以及胞內參與信號傳導的區域，所述嵌合CD28基因編碼的胞內參與信號傳導的部分為小鼠來源，所述嵌合CD28基因編碼的胞外區域包含人CD28蛋白胞外域的部分片段，同時該小鼠來源部分和人源部分通過序列拼接連接于小鼠動物模型內源的Cd28啟動子后。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述小鼠來源部分包括Cd28基因的1號外顯子全部序列、2號外顯子部分序列、3號外顯子部分序列及其后所有外顯子的全部序列。

4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，使用基因編輯技術進行CD28人源化小鼠動物模型的構建，所述基因編輯技術包括利用胚胎干細胞的基因打靶技術、CRISPR/Cas9技術、鋅指核酸酶技術、轉錄激活子樣效應因子核酸酶技術或歸巢核酸內切酶。

5.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，將小鼠來源的Cd28的2號外顯子至3號外顯子的部分序列替換為人源CD28的2號外顯子至3號外顯子部分序列，使用sgRNA靶向的5’端靶序列如SEQ ID NO：4所示，靶向的3’端靶序列如SEQ ID NO：17所示。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述人源化CD28蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示。

7.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述嵌合CD28基因編碼權利要求6所述的人源化CD28蛋白，或所述的嵌合CD28基因選自下列組中的一種：

a）CDS序列為SEQ ID NO：31所示的序列；

b）轉錄的mRNA序列為SEQ ID NO：32所示的序列；

或c）來源于人CD28基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：35所示的序列。

8.一種靶向載體，其包含：a）與待改變的轉換區5’端同源的DNA片段，即5’臂；b）插入或替換的供體DNA序列，其編碼供體轉換區；c）與待改變的轉換區3’端同源的第二個DNA片段，即3’臂；所述供體DNA序列為人CD28基因的核苷酸序列，所述的人CD28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示，所述的待改變的轉換區位于Cd28基因的2號外顯子至3號外顯子，所述5’臂序列如SEQ ID NO：34所示；所述3’臂序列如SEQ ID NO：36所示。

9.一種構建人源化小鼠動物模型的載體，其特征在于，所述載體包含sgRNA，用于敲除或替換Cd28基因的2號外顯子至3號外顯子的部分，所述sgRNA靶向的5’端靶序列如SEQ IDNO：4所示，sgRNA靶向的3’端靶序列如SEQ ID NO：17所示。

10.一種權利要求8所述的靶向載體、權利要求9所述的載體在敲除或替換CD28基因的2號外顯子至3號外顯子的部分中的應用。

11.一種CD28基因人源化細胞株，其特征在于，所述人源化細胞株基因組中包括嵌合CD28基因，所述的嵌合CD28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示，該人源化細胞株可表達人源化CD28蛋白，同時細胞株內源CD28的蛋白表達降低或缺失，所述的細胞株來源于小鼠，所述的細胞株不能發育為個體。