[發明專利]靶向CD19和EBNA1基因修飾的T細胞及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201810615864.2
• 申請日: 2018-06-14
• 公開（公告）號: CN108841792A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 錢文斌;陸哲明;張超亭;雷文
• 申請（專利權）人: 浙江大學;北京市腫瘤防治研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 黃歡娣;邱啟旺

本發明涉及分子生物學領域，具公開了一種同時靶向CD19和EBNA1的基因修飾T細胞。所述T細胞同時具有靶向CD19的CAR和靶向EBNA1的TCR，其不僅可以靶向識別表達CD19的腫瘤細胞，而且在CD19低表達或不表達時，可以靶向識別表達EBNA1的腫瘤細胞，從而為EBV陽性B細胞來源的腫瘤提供一種新的治療手段。而且，本發明優化了該基因修飾T細胞的培養過程，提高該基因修飾T細胞識別EBNA1的比例。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及一種同時靶向CD19和EBNA1的基因修飾T細胞及其制備方法與應用。

背景技術

近年來，靶向CD19的CAR-T在治療復發，耐藥，難治B細胞白血病和淋巴瘤方面取得了舉世矚目的成就，引起世界各國腫瘤臨床醫生的極大興趣。但是僅靶向CD19的CAR-T治療B細胞來源腫瘤會導致腫瘤細胞CD19低表達或不表達，從而導致腫瘤細胞免疫逃逸而產生復發和耐藥。因此同時靶向CD19的CAR和靶向EBNA1的TCR可以同時靶向B細胞來源的EBV陽性腫瘤的CD19和EBNA1兩個靶點，因此對于B細胞來源EBV陽性腫瘤尤其是CD19 CAR-T治療失敗的患者，雙靶點基因修飾T細胞預期會取得較好的治療效果。CD19是B細胞系的細胞，包括正常的B細胞，前B細胞，B細胞淋巴瘤和白血病細胞，特異性表達的膜蛋白,其他細胞和組織都不表達CD19；而EBNA1是所有EBV陽性腫瘤均表達的蛋白。因此，對于B細胞來源EBV陽性腫瘤尤其是CD19 CAR-T治療失敗的患者，雙靶點基因修飾T細胞會取得較好的治療效果。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種同時靶向CD19和EBNA1的基因修飾T細胞及其制備方法與應用。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

第一方面，本發明培養一種同時靶向CD19和EBNA1的基因修飾T細胞。

本發明將靶向CD19的CAR構建于慢病毒載體進而轉入患者T細胞，使該基因修飾的T細胞可以靶向識別表達CD19的腫瘤細胞。但是僅靶向CD19的CAR在B細胞來源腫瘤的治療中易導致腫瘤細胞CD19的低表達乃至不表達，因此易導致疾病進展乃至復發。但由于部分B細胞來源腫瘤會感染EBV，而感染EBV的腫瘤細胞會表達EBNA1，因此將靶向CD19的CAR感染患者外周血T細胞后，應用商品化的EBNA1抗原肽對其進行兩周期體外刺激，以期靶向CD19的CAR-T亦能特異識別EBNA1，最終同時靶向CD19和EBNA1的基因修飾T細胞預期會有更強的治療效果。

第二方面，本發明提供上述雙靶向T細胞的制備方法：將EBNA1抗原肽負載DC細胞，獲得負載抗原肽的DC細胞；將負載抗原肽的DC細胞與靶向CD19的CAR-T共培養，即獲得同時靶向CD19和EBNA1的基因修飾T細胞。

其一，靶向CD19的CAR-T的構建方案為：將靶向CD19的CAR構建于慢病毒載體，進而轉入T細胞。具體步驟如下：

(1)合成表達靶向CD19的CAR的核苷酸序列,合成所述基因時在其兩端分別包含XbaI和SalI酶切位點，并將其裝載在質粒上；

(2)利用XbaI和SalI雙酶切步驟(1)所述質粒，切膠回收目的基因片段；

(3)利用XbaI和SalI雙酶切慢病毒原始載體，切膠回收的載體片段；

(4)利用DNA連接酶將步驟(2)回收的目的基因片段與步驟(3)回收的載體片段連接，即得。

由于慢病毒感染外周血T細胞的效率普遍不高，為了促進靶向CD19的CAR在T細胞中可進行高效的表達，本發明進一步優選了慢病毒載體啟動子種類，以求對T細胞發揮最佳的感染效率。啟動子EF1α，使得該慢病毒載體產生的慢病毒可以高效感染外周血T細胞，而且靶向CD19的CAR可以高效表達于該T細胞表面。