[發明專利]一種用于檢測牛結核病的ELISpot檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201810614743.6
• 申請日: 2018-06-14
• 公開（公告）號: CN109061166B
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 焦新安;陳祥;李昕;徐正中;劉佳瑩;孟闖;孫林
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C07K16/24
• 分類號: C07K16/24;G01N33/577
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 李艷;許亦琳

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測牛結核病的ELISpot檢測試劑盒及其在牛結核病診斷領域的應用。所述檢測試劑盒中包括支持介質、捕獲抗體、檢測抗體，所述捕獲抗體可由保藏號為CCTCC NO：C2017283的雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產生，所述檢測抗體為與所述捕獲抗體不同的γ干擾素單克隆抗體。本發明試劑盒與牛結核病BOVIGAM^?ELISA檢測試劑盒、牛結核病抗體檢測試劑相比，能夠實現牛分枝桿菌感染的更靈敏、高特異性檢測，排除了交叉反應帶來的假陽性干擾，顯示了良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測牛結核病的ELISpot檢測試劑盒及其在牛結核病診斷領域的應用。

背景技術

牛結核病是由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)引起的人獸共患慢性傳染病，以組織器官的結核結節性肉芽腫和干酪樣、鈣化的壞死病灶為特征，多侵害肺、乳房、腸和淋巴結等。嚴重威脅牛群的健康狀況，對畜牧業生產和人類健康造成非常大的危害。

結核分枝桿菌是一種兼性胞內寄生菌，感染機體后可引起細胞免疫應答，進而產生一系列細胞因子，在機體對抗感染的過程中發揮重要作用。在機體感染結核分枝桿菌時，特定的免疫原性蛋白可以激活T細胞反應，包括活化巨噬細胞和CD4⁺T細胞和CD8⁺毒性T細胞，產生幾種重要的細胞因子，如γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。這些細胞因子在清除機體內結核分枝桿菌的過程中起著重要的作用。特別是IFN-γ的分泌是宿主產生T細胞免疫反應的重要指標，其在對抗結核分枝桿菌感染中發揮重要作用，通過檢測抗原特異性的IFN-γ分泌狀況可間接反映機體在結核分枝桿菌感染后的細胞免疫狀況。

IFN-γ主要是由特異性抗原刺激而活化的CD4⁺Th1細胞、CD8⁺T細胞及NK細胞等產生的細胞因子，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫調節功能，是機體防御系統的重要組成部分。IFN-γ的免疫學檢測是在特異性抗IFN-γ單克隆抗體(MAb)的基礎上建立的用于對樣本中的IFN-γ進行定性定量分析的實驗方法。應用不同的單克隆抗體標記物和檢測技術，已經開發出多種方法，如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，酶聯免疫斑點法(ELISpot)，流式細胞術(FCM)分析法等。

現階段牛結核病的檢測方法主要包括以下幾種：(1)細菌學方法，通過培養病原體，根據其生物學特征進行判斷，診斷的可靠性和準確性較高；但是牛分枝桿菌生長緩慢，分離率低(20％左右)，需要生物安全措施，同時對于病理部分樣品的采集需要屠宰奶牛，不適用于活畜的檢疫，嚴重影響了該方法的推廣；(2)分子生物學技術，如建立的結核分枝桿菌屬特異性的PCR檢測方法，但實驗條件要求較高，不便于普及；(3)免疫學檢測方法包括血清學檢測和細胞免疫檢測，一般認為分枝桿菌引起的機體免疫應答以細胞免疫為主，而非體液免疫，因此檢測抗體的ELISA方法應用價值受限。目前在我國牛結核病檢疫過程中，主要采用牛型結核菌素(以下簡稱PPD)進行單純頸部皮試變態反應，但該方法存在較多的假陽性。另外，該方法具有操作過程困難，試驗所需時間較長、受外界干擾因素較多、結果判定主觀性較強等一系列缺點。(4)γ-干擾素ELISA檢測試驗，γ-干擾素釋放試驗的基本原理同TST，但整個操作過程在體外進行。與TST相比，γ-干擾素ELISA檢測試驗不僅具有較高的敏感性和特異性，而且結果更加客觀可靠，檢測結果不受前者影響，同時只需與動物接觸一次，對野生動物和難以保定的大型動物的檢測具有巨大的優越性。同時，γ-干擾素釋放試驗模擬了結核分枝桿菌感染機體的免疫應答，在一定程度上反映了結核分枝桿菌感染早期宿主的免疫狀態，所以此方法可用作結核病的早期感染檢測，特別是結核分枝桿菌處于潛伏感染狀態下機體沒有明顯的體液免疫應答和病理變化時，該方法更具優勢。但γ-干擾素ELISA檢測試驗是群體水平檢測，若群體細胞因子水平提高，ELISA不能區分是分泌細胞因子的細胞數量增加，還是單個分泌水平增加。這種區別對研究生物體的細胞免疫是很重要的，但是群體水平的檢測不能區別出來，只有單細胞水平的檢測能夠勝任。