[發明專利]GnRH-防御素重組去勢疫苗及其制備

有效

• 申請號: 201810612943.8
• 申請日: 2018-06-14
• 公開（公告）號: CN108904788B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 劉昕;王弋;皮川真;汪業軍;林少妹
• 申請（專利權）人: 廣州源博醫藥科技有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P15/16;A61P15/18;C07K19/00;C12N15/70
• 代理公司: 廣州專理知識產權代理事務所(普通合伙) 44493
• 代理人: 譚昉

本發明屬于分子生物學技術領域，描述了含有編碼免疫避孕蛋白促性腺激素釋放激素(GnRH)與異源防御素多肽（HDP）的融合疫苗。本發明公開了重組GnRH?HDP融合蛋白疫苗的構建及轉化表達和純化，通過接種動物后，免疫產生避孕肽特異性抗體，從而控制動物生育力的方法。所述方法中的GnRH?HDP防御素免疫原性組合物，能有效控制動物生育能力。

技術領域

本發明涉及分子疫苗學領域，具體的說是GnRH-防御素重組去勢疫苗及其制備方法。

背景技術

動物所用的去勢技術一直是手術去勢，對動物應激很大，一般需要7-10天才能恢復，而且有時候會因為傷口感染引起寵物死亡。此外對雌性寵物的手術法去勢，不僅感染風險較大，而且對操作人員的技術和體力均有很高的要求。此外，在很多國家和地區，動物福利中的激進分子一直施加壓力以制止進行手術去勢。而一種替代手術去勢方法的選擇就是采用GnRH 去勢疫苗接種，消除促性腺激素釋放因子（GnRH，也稱為LHRH）在體內的影響，使動物體不能性成熟，與手術去勢相比，安全方便，減少感染機會。

促性腺激素釋放激素(GnRH)是從垂體前葉釋放的肽類激素，主要負責調節卵泡刺激激素(FSH)和促黃體生成激素(LH)的合成和釋放。GnRH 也被稱為GnRH1、促黃體生成激素釋放激素(LHRH)、促性腺素釋放素原-1和促性腺素釋放素原-1前體。術語“GnRH”包括GnRH類似物和變體，包括含有取代、缺失或插入的GnRH 分子。在雄性和雌性中，GnRH 從下丘腦釋放到血液中并通過血液移動到垂體，它在那里誘導促性腺激素分別誘導促黃體生成激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的釋放。在生長的雄性動物中，LH促進睪丸發育和睪丸甾類的合成。在生長的雌性動物中，FSH刺激卵巢發育和其中的卵泡發育、卵巢甾類的合成和排卵，從而保證了動物的生殖能力。故控制動物繁殖的一條途徑可以通過免疫GnRH，誘導GnRH的抗體，體內中和GnRH，法減少GnRH水平，導致LH和FSH合成減少，而伴隨發情周期和精子生成的破壞，從而達到絕育的目的。

凡有免疫原性的物質，多屬大分子膠體。一般而言，分子量越大，免疫原性越強。天然蛋白質的分子量多在10K D 以上，才具有良好的免疫原性；分子量小于4KD 的，一般不具有較好的免疫原性。由于GnRH肽為十肽分子量僅1.2KD ，其免疫原性極低。單獨免疫該肽，或者簡單的重復串聯，都不能引起較好的免疫反應，其無法有效地起到控制生殖的目的。

為了在受激動物中引發明顯的免疫應答，小蛋白或內源物質可以和適當的載體結合。載體的作用是非特異地刺激T輔助細胞活性并與主要組織相容性復合物（MHC）的分子結合以引導抗原在抗原呈遞細胞的細胞表面對該肽的加工和呈現。有報道利用白喉毒素蛋白作為載體連接四聯GnRH蛋白，能夠有效的提高GnRH的免疫效果。因此本專利采取四聯GnRH蛋白提高蛋白分子量的同時，并引入防御性連接多肽，串聯四個四聯GnRH蛋白，進一步提高了其分子量，提高了其免疫原性。

防御素是一類富含精氨酸和半胱氨酸殘基的小分子、多功能的陽離子多肽；一般由18-45個氨基酸殘基構成。防御素可分為5種類型，即α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆蟲防御素和植物防御素。哺乳動物只表達α-防御素和β-防御素。β-防御素可以誘導肥大細胞脫顆粒并釋放組胺。β-防御素可以募集并促進未成熟樹突狀細胞和記憶性T細胞的成熟，并激活特定的免疫反應。β-防御素可以加強巨噬細胞吞噬反應，促進中性粒細胞募集，調節補體激活，趨化未成熟T細胞和樹突狀細胞。已有文獻報道防御素和疫苗（如乙肝疫苗、RSV F蛋白疫苗）共同注射對機體的免疫刺激增強，免疫效果更好。但是以上防御素都是作為佐劑單獨使用，其多肽的性質導致其容易降解，并不容易保存，導致其制備的疫苗需要通過保護劑和特殊包裝方式才能發揮佐劑效果。