[發明專利]羅湖病毒（TiLV）的RAA恒溫熒光檢測方法及試劑

在審

• 申請號: 201810607232.1
• 申請日: 2018-06-13
• 公開（公告）號: CN110592268A
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發明（設計）人: 劉葒;錢冬;程奇;王津津;黃震巨;張建勛;肖文;余國君;史秀杰;鄭曉聰;賈鵬;于力;何俊強;劉瑩;溫智清
• 申請（專利權）人: 杭州眾測生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 33283 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 向慶寧

本發明公開了一種羅湖病毒（TiLV）RAA恒溫熒光檢測方法和檢測試劑盒。檢測試劑盒包括一條正向引物SEQ ID NO.1、一條反向引物SEQ ID NO.2、一條特異性熒光探針SEQ ID NO.3、反應液、逆轉錄酶、重組聚合酶和對照品。本發明的試劑盒特異性強；檢測靈敏度高，可達到10fg/μL；準確度高、可靠；操作簡便快捷，適合現場檢測，具有廣泛的應用場景。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及海洋水產養殖業的檢測方法，具體涉及一種羅湖病毒的RAA恒溫熒光檢測方法及試劑盒。

背景技術

羅湖病毒(Tilapia Lake Virus，TiLV)，是近年來發現并報道的一種新興病毒，該病毒最早于2009年在以色列發現，目前已經在哥倫比亞、厄瓜多爾、埃及、以色列和泰國得到確認。雖然該病原體不會引起公共衛生問題，但可以導致受感染種群大量死亡。據報道，該病毒具有較強的傳染性，已經給以色列、厄瓜多爾、埃及等國養殖的羅非魚造成大面積死亡，死亡率高達70％。

據聯合國糧農組織發布的消息，羅湖病毒有可能比目前已知的分布范圍更廣，給全球羅非魚養殖造成嚴重威脅，目前已經引起多個國家的重視并進行積極的監視。羅湖病毒是一種負鏈RNA病毒，基因組由10個獨立的基因片段組成，目前仍未確定其分類地位，極有可能是正粘病毒科的一種新型病毒，羅湖病毒在24-33℃均可以生長，最適生長溫度25℃。2017年5月，我們首次從國內養殖的羅非魚中檢測出該病毒。鑒于羅湖病毒引起的高死亡率和重大經濟損失，為了及早發現養殖羅非魚是否被羅湖病毒感染，有必要建立一種快速、準確、靈敏的檢測方法。

目前，尚缺乏有效控制羅湖病毒的藥物和方法。目前TILV檢測方法主要是RT-PCR方法。雖然PCR方法敏感、準確、快速，可替代病原學檢測，但由于需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術要求而使其不適用于現場快速檢測及基層普及應用。與一般PCR技術相比，熒光PCR檢測技術簡化了操作步驟，而且可消除擴增產物引起的交叉污染，減少假陽性的發生。但實時熒光PCR耗時長，成本較高，目前在水產養殖動物的常規病原體檢測中的應用還不多。本發明建立了RAA恒溫熒光來檢測羅湖病毒的方法，快速方便，準確可靠，是適應口岸快速檢測和大通關的時代要求，對促進中國海洋養殖及其產品的貿易有重要作用。

重組酶介導擴增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技術也是一種在恒溫下可以使核酸快速擴增的方法。與RPA不同的是，RAA擴增法使用的是從細菌或真菌中獲得的重組酶，在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，反應產物也是以指數級增長，通常在1h內即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增片段。在RAA反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監控整個RAA擴增過程，20分鐘內，可實現對起始模板的定量及定性分析。整個反應簡單快速，因為不需要高溫循環，所以特別適合在有大量樣品的非實驗室檢測場所使用，適用于食品快速檢測領域。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供羅湖病毒(TILV)的RAA恒溫熒光核酸檢測試劑盒及檢測方法。

為實現以上目的，本發明采用以下技術方案：

一種羅湖病毒(TILV)核酸的檢測試劑盒，包括：羅湖病毒正向引物、反向引物以及特異性熒光探針，其中所述羅湖病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述羅湖病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ IDNO.3，其5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。