[發明專利]一種特異性結合魚類小清蛋白的核酸適配體、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201810599546.1
• 申請日: 2018-06-12
• 公開（公告）號: CN108918885B
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 王彥波;戚琴芹;傅玲琳;王翀;周瑾茹;王飛飛
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/532;G01N21/41;C12N15/115
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種特異性結合魚類小清蛋白的核酸適配體、試劑盒及檢測方法。本發明通過篩選獲得了兩條能夠特異性與魚類小清蛋白結合的核酸適配體，每一條均能用于特異性檢測樣品中的魚類小清蛋白，兩條核酸適配體的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本發明針對這兩條核酸適配體開發了一種基于SPR技術特異性檢測魚類小清蛋白的方法，操作簡單、靈敏度高、有很強的特異性，具有極好的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別是涉及一種特異性結合魚類小清蛋白的核酸適配體、試劑盒及檢測方法。

背景技術

魚是常見的八大過敏性食物之一，其中，小清蛋白(parvalbumins，PV)是其主要過敏原，據統計，95％以上的魚類過敏患者的過敏癥狀是由小清蛋白引起的。PV的分子量為10～14kD，等電點為3.9～5.5，主要存在于魚肉的肌漿蛋白部分，不同魚類的PV之間存在著免疫交叉反應性，表明PV具有很高的氨基酸同源性。

酶聯免疫吸附法(ELISA)是魚類小清蛋白的主要檢測方法。比如申請公布號為CN102707064A的中國發明專利公開了一種能靈敏檢測出淡水魚主要過敏原小清蛋白的方法，包括以下步驟：1)淡水魚鰱魚小清蛋白標準品的制備；2)抗鰱魚小清蛋白單克隆抗體的制備；3)抗鰱魚小清蛋白單克隆抗體的生物素標記；4)魚類小清蛋白競爭性ELISA檢測方法的建立；5)待檢樣品中魚類小清蛋白的檢測。但是ELISA普遍存在假陽性和假陰性的現象。因此發明準確、簡便、高靈敏度的魚類小清蛋白痕量檢測方法具有重大意義。

公開號為CN105911127A的中國發明專利公開了一種用毛細管電泳快速檢測魚類小清蛋白的方法，包括如下步驟：(1)提取魚肌肉中的全蛋白并溶于pH為7～8的平衡緩沖液中，然后加入陰離子交換層析柱中，洗脫液洗脫，收集穿透峰所對應的溶液即為樣品；(2)將所得樣品進行毛細管區帶電泳，得電泳圖譜，將電泳圖譜中所得峰面積代入魚類小清蛋白的標準曲線回歸方程中計算得到樣品液中魚類小清蛋白的濃度。這種方法受干擾因素較多，特別是在樣品檢測時，全蛋白樣品中蛋白種類多且雜，容易干擾檢測結果的準確性。

核酸適配體(Aptamer)是通過指數富集的配體系統進化技術(SELEX)篩選得到的，能與靶標產生空間結構匹配的高親和力和特異性結合的一段單鏈DNA或RNA分子。相對于抗體，核酸適配體具有選擇性高、易合成、易修飾和相對穩定等優點。

發明內容

本發明首次將篩選得到的一對核酸適配體應用于檢測魚類小清蛋白，建立基于核酸適配體的表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)的魚類小清蛋白檢測方法。

一種特異性結合魚類小清蛋白的核酸適配體，核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQID No.2所示。

本發明又提供了一種用于特異性檢測魚類小清蛋白的試劑盒，包含如權利要求1所述的核酸適配體。

本發明又提供了另一種用于特異性檢測魚類小清蛋白的試劑盒，包含一對特異性結合魚類小清蛋白的核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示。

上述兩條核酸適配體均為篩選到的可以與魚類小清蛋白特異性結合的，使用其中任意一條核酸適配體即可以用于特異性檢測魚類小清蛋白，但是使用一對核酸適配體時其中的另外一條可以與納米金結合，起到一個信號放大的作用。使用納米金結合核酸適配體與單條的核酸適配體和第二條核酸適配體沒有納米金修飾比較時，能夠有效提高SPR檢測器的信噪比和檢測靈敏度。連接一個熒光基團可以檢測核酸適配體和小清蛋白的結合情況，但是用SPR和納米金可以達到更好的檢測效果。

本發明還提供了一種基于SPR的魚類小清蛋白檢測方法，包括以下步驟：

(1)將生物素化的第一核酸適配體偶聯到空白SPR傳感器芯片上獲得檢測用SPR傳感器芯片，