[發(fā)明專利]獲得無標記轉(zhuǎn)基因植物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810590142.6
• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN108753813B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王克劍;王俊杰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N9/22;A01H5/00;A01H6/46;A01H6/82;A01H6/00
• 代理公司: 北京康信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 韓建偉;金田蘊

本發(fā)明公開了一種獲得無標記轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法通過CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系統(tǒng)實現(xiàn)，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的載體中包含基因編輯蛋白基因、靶向載體自身的sgRNA和特異時空表達基因啟動子，特異時空表達基因啟動子在愈傷組織時期不表達，待完成遺傳轉(zhuǎn)化后表達基因編輯蛋白基因。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，操作簡單，主要針對農(nóng)作物或經(jīng)濟植物，尤其是多年生，無性繁殖的植物，通過剪切載體本身，產(chǎn)生大片段轉(zhuǎn)基因成分的丟失，意義重大。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種獲得無標記轉(zhuǎn)基因植物的方法。

背景技術(shù)

目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)廣泛的用于基因功能的研究，隨著商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物新品種的不斷出現(xiàn),人們對轉(zhuǎn)基因植物安全性問題的爭論和擔(dān)憂日益增加。CRISPR/Cas9技術(shù)是新興的基因編輯工具，可以在特定位點產(chǎn)生DSB，借由生物體對DNA的修復(fù)過程中，可能產(chǎn)生插入、缺失、替換等現(xiàn)象，從而定點獲得突變體，隨著基因編輯技術(shù)的不斷優(yōu)化，CRISPR/Cas9技術(shù)用于基因敲除已經(jīng)相當完善，但是Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生靶向敲除之后對于植物本身的生長發(fā)育并沒有改善，反而是Cas9的存在增加了脫靶的概率，對于商品生產(chǎn)來說是不穩(wěn)定因素。對于一年生植物來說在生殖過程中存在一定的幾率自然分離掉marker基因/Cas9編碼基因，但是自然發(fā)生的概率相當小不能應(yīng)用于生產(chǎn)中，且對于多年生經(jīng)濟作物來說，很難得到無轉(zhuǎn)基因成分植株。目前人們通過轉(zhuǎn)座途徑、染色體內(nèi)同源重組、目標基因與標記基因共轉(zhuǎn)化、位點專一性重組等措施來剔除外源基因。

本發(fā)明基于目前廣泛應(yīng)用的CRISPR/Cas9技術(shù)，以特異表達啟動子(愈傷組織不表達)驅(qū)動Cas9表達，并且除原有敲除位點之外，在T-DNA插入序列兩端額外設(shè)計兩個靶位點，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，在特異時期表達的Cas9蛋白通過靶向敲除靶點在植物基因組產(chǎn)生突變，同時T-DNA出去邊界靶點，經(jīng)過Cas9剪切也產(chǎn)生DSB，使得T-DNA插入序列從基因組上去除，產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因突變體植株。隨著基因敲除技術(shù)的廣泛應(yīng)用，構(gòu)建突變體庫用于基因研究，但是由于基因敲除得到的突變體存在一定的安全問題，國家對于轉(zhuǎn)基因的界定還不明朗，對于基因敲除構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因突變庫的應(yīng)用在生產(chǎn)育種中顯得不太方便，并且通過轉(zhuǎn)基因植物自體繁殖分離轉(zhuǎn)基因成分效率低下，且對于多年生植物，以及無性繁殖的植物來說不能分離轉(zhuǎn)基因成分。本發(fā)明可以經(jīng)過一代獲得不含Cas9蛋白，標記基因等外源序列的突變體，方便快捷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種獲得無標記轉(zhuǎn)基因植物的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中，以解決現(xiàn)有技術(shù)中獲得無標記轉(zhuǎn)基因植物操作繁瑣的技術(shù)問題。

為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種獲得無標記轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法通過CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系統(tǒng)實現(xiàn)，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的載體中包含基因編輯蛋白基因、靶向載體自身的sgRNA和特異時空表達基因啟動子，特異時空表達基因啟動子在愈傷組織時期不表達，待完成遺傳轉(zhuǎn)化后表達基因編輯蛋白基因。

進一步地，啟動子具有如LOC_Os07g01820所示的核苷酸序列。

進一步地，基因編輯蛋白基因為Cas9基因或Cpf1基因。

進一步地，載體還包含配套的Cas9基因或Cpf1基因的元件。

進一步地，載體為雙元表達載體。

進一步地，雙元表達載體為Pcambia 1300。

進一步地，植物包括水稻、小麥、馬鈴薯、紅薯、楊樹和柑橘。

應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，操作簡單，主要針對農(nóng)作物或經(jīng)濟植物，尤其是多年生，無性繁殖的植物，通過剪切載體本身，產(chǎn)生大片段轉(zhuǎn)基因成分的丟失，意義重大。

附圖說明