[發(fā)明專利]DNA甲基化檢測探針

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810590112.5
• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN110577986A
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳琦;梁昊原;谷東風(fēng)
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市圣必智科技開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開一種DNA甲基化檢測探針，包括5’端和3’端的用于與甲基化DNA互補配對的序列，其中，檢測探針3’端的最后三個堿基均為鳥嘌呤，所述鳥嘌呤與甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配對，且檢測探針3’端的序列與甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶至3’端的序列反向互補配對，檢測探針5’端的序列與甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶的臨近脫氧核苷酸至5’端的序列反向互補配對。本DNA甲基化檢測探針能夠提高DNA甲基化檢測的靈敏度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種DNA甲基化檢測探針。

背景技術(shù)

隨著人類基因組計劃的完成，下一個重要任務(wù)之一就是解密遺傳系統(tǒng)， 即人體細(xì)胞在生長過程中是如何運用遺傳物質(zhì)來決定某一特定基因在何時何 地得到表達(dá)。

DNA甲基化因其能影響基因表達(dá)的遺傳狀態(tài)，已成為表觀遺傳系統(tǒng)中的 一個重要部分。哺乳動物的DNA甲基化大多發(fā)生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶上， 即在胞嘧啶的嘧啶環(huán)上5號碳位置加入甲基。

在正常細(xì)胞中，甲基化主要發(fā)生在重復(fù)的基因組區(qū)域，包括遺傳元件和 衛(wèi)星脫氧核苷酸，然而與基因啟動子和外顯子相關(guān)的CpG島嶼通常是沒有甲 基化的。但是在這些區(qū)域上突變性的DNA甲基化能導(dǎo)致癌癥抑制基因的轉(zhuǎn)錄 沉默，這種突變性的DNA甲基化可以作為各種疾病包括癌癥的標(biāo)志。CpG島 嶼上特定區(qū)域的甲基化可能與特定類型的癌癥相關(guān)。因此，人類基因組中任 一給定位置上DNA甲基化的準(zhǔn)確定量對于人類癌癥的早期治療是非常重要 的。

傳統(tǒng)的已有多種用于分析單個CpG位置或短序列中DNA甲基化的檢測方 法。甲基化特異性的PCR(MSP)開啟了將聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用于甲基化 分析的大門，但由于MSP的分析結(jié)果是通過觀察凝膠電泳的現(xiàn)象，導(dǎo)致MSP 僅能提供實驗的定性分析而非定量分析。熒光標(biāo)記實時監(jiān)測PCR和甲基化特 異性的量子點的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(MSq-FRET)等方法都需要精密控溫的PCR 儀，且一般需要使用熒光染料分子標(biāo)記的探針，大大加重了實驗成本。結(jié)合 亞硫酸鹽的限制性消化分析方法(COBRA)給定量且靈敏的DNA甲基化的檢 測提供了另一種選擇，但是COBRA的前提條件是分析樣品中要有甲基化敏感 性的限制性消化酶的酶切位點。基于表面增強拉曼光譜法和單核苷酸擴增方 法，由于較低的靈敏度導(dǎo)致應(yīng)用受限。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種DNA甲基化檢測探針，旨在提高DNA甲 基化檢測的靈敏度。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種DNA甲基化檢測探針，包括5’端和3’ 端的用于與甲基化DNA互補配對的序列，其中，檢測探針3’端的最后三個堿 基均為鳥嘌呤，所述鳥嘌呤與甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配對，且檢測 探針3’端的序列與甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶至3’端的序列反向 互補配對，檢測探針5’端的序列與甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶的 臨近脫氧核苷酸至5’端的序列反向互補配對。

優(yōu)選的，所述檢測探針的DNA序列是SEQ ID NO:1。

優(yōu)選的，所述3’端包括13個堿基。

優(yōu)選的，所述5’端包括21個堿基。

優(yōu)選的，所述DNA甲基化檢測探針還包括中間部分的用于引發(fā)超分支滾 環(huán)擴增反應(yīng)的特異性序列，所述特異性序列包括正向引物和反向引物。

優(yōu)選的，所述正向引物的長度為25個。

優(yōu)選的，所述正向引物為SEQ ID NO:3。

優(yōu)選的，所述反向引物的長度為23個。

優(yōu)選的，所述反向引物為SEQ ID NO:4。

本技術(shù)方案中，DNA甲基化檢測探針3’端的最后三個堿基均為鳥嘌呤， 能夠更大概率的檢測到發(fā)生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶上的DNA甲基化，因此， 相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有靈敏度高的特點。