[發(fā)明專利]一種基于交聯(lián)反應的核酸適配體的快速篩選方法及篩選獲得的結(jié)構開關型核酸適配體

有效

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• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN110577979B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設計）人: 婁新徽;喬娜;吳曉;刁冬林
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/115
• 代理公司: 北京展翅星辰知識產(chǎn)權代理有限公司 11693
• 代理人: 王文生

本發(fā)明涉及一種基于交聯(lián)反應的核酸適配體的快速篩選新方法及其通過該方法篩選獲得的人血清白蛋白的結(jié)構開關型核酸適配體。本方法中靶標與核酸適配體文庫進行均相孵育，然后通過交聯(lián)反應將靶標捕獲在磁珠上，這樣與靶標結(jié)合的核酸序列被捕獲在磁珠上；將磁性分離出來的與靶標結(jié)合的核酸序列通過聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增；將雙鏈PCR產(chǎn)物進行單鏈制備得到次級文庫，次級文庫進入下一輪的篩選。將上述過程循環(huán)2?3輪可以實現(xiàn)對文庫的快速富集。該方法還可以與其它篩選技術聯(lián)用，大幅提高篩選效率。按照本方法經(jīng)3輪富集后的文庫僅經(jīng)過1輪基于文庫固定的篩選方法就得到了具有高親和力和選擇性的HSA的SSA。

技術領域

本發(fā)明涉及一種基于交聯(lián)反應的核酸適配體的快速篩選方法及篩選獲得的人血清白蛋白的結(jié)構開關型核酸適配體，屬于生物技術領域。

背景技術

核酸適配體的篩選技術，即富集配體進化技術(Systematic Evolution ofLigandsby Exponential Enrichment，SELEX)(Nature,1990,346(6287),818-822；Science,1990,249(4968),505-510.)是一種以體外合成文庫、聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)以及測序等技術為基礎建立的核酸適配體體外篩選技術。SELEX技術的基本原理是將寡聚核苷酸(DNA或者RNA)文庫與特定的靶標分子進行孵育，通過分離技術將與靶標分子結(jié)合的寡聚核苷酸分離出來，通過PCR技術進行指數(shù)擴增，將得到的產(chǎn)物進行單鏈制備得到次級文庫，將次級文庫作為下一輪的起始文庫重新開始新一輪的篩選。通過多輪的篩選過程，最終獲得具有高親和力、高特異性的核酸適配體。

SELEX技術自提出以來，在多個領域得到了廣泛的應用。然而傳統(tǒng)的SELEX技術操作繁瑣，篩選周期較長。為了加快核酸適配體的篩選過程，近些年來發(fā)展了多種改進的SELEX技術，縮短了篩選周期。這些改進技術多是通過對SELEX過程中的分離步驟進行改進，將傳統(tǒng)的基于親和柱或者醋酸纖維素膜的分離技術用更為高效或者便捷的分離方式替代。這些改進的方法包括：磁珠分離(Nucleic Acids Research 2003,31(18),e110-e118.)、毛細管電泳技術(Analytical Chemistry 2004,76(18),5387-5392.)、凝膠電泳技術(Nucleic Acids Research 2005,33(17),e141-e147.)、微流控芯片法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2009,106,2989-2994.)、表面等離子體共振技術(Analytical Biochemistry 2005,342(2),312-317.)。盡管近些年來多種核酸適配體篩選技術不斷出現(xiàn)，但是核酸適配體的篩選依然富有挑戰(zhàn)性，常常面臨篩選失敗的問題，迫切需要新的篩選技術。

在目前的各種核酸適配體篩選技術當中，基于靶標固定的方法由于其操作便捷，應用最為廣泛。但是固定靶標分子的核酸適配體篩選方法中固相基質(zhì)存在嚴重的非特異性吸附，靶標在固相表面固定還會掩蔽靶標的結(jié)合位點，影響靶標的構象，具有很大的不確定性。這些因素都會造成核酸適配體篩選效率低，甚至失敗。均相核酸適配體的篩選方法避免了此類問題，不需要將靶標分子固定到固相介質(zhì)上，而是將文庫直接與靶標分子在溶液中孵育，隨后進行分離。由于篩選過程中靶標分子處于自由的游離狀態(tài)，與實際樣品中所處的狀態(tài)相同，因而通過均相篩選技術獲得的核酸適配體理論上更加適合于后期的應用。目前均相的核酸適配體篩選技術包括毛細管電泳法(Journal of the American ChemicalSociety 2005,127(9),3165-3171.)、硝化纖維素膜分離法(Journal of GeneralVirology 2006,87(3),479-487.)、離心分離法(International Journal forParasitology 2003,33(12),1309-1317.)、凝膠電泳分離法(ChemistryBiology 1995,2(11),741-750.)以及氧化石墨烯的分離法(Chemical Communications 2014,50(72),10513-10516.)等。