[發(fā)明專利]一種體外擴增臍血NK的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810589681.8
• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN108676775B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設計）人: 李妍;張怡;劉春香;翟瑩;劉艷青
• 申請（專利權(quán)）人: 天晴干細胞股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 賈澤純

1.一種體外擴增臍血NK的方法，其特征在于它的具體步驟如下：

一、在T75培養(yǎng)瓶中按體積比為1:4的比例加入包被液和生理鹽水；1mL包被液中包含成分：濃度為3～7μg/mL的CD16單抗、濃度為800～1200μg/mL的IFN-γ和濃度為400～600IU/mL的GM-CSF；搖晃細胞瓶使包被液鋪滿瓶底，室溫下靜置1h，去除包被液，用生理鹽水洗瓶底一次，去除生理鹽水，放置T75培養(yǎng)瓶備用；

二、臍血中單個核細胞的激活

A、單個核細胞的分離：

將80～100mL的臍血分裝于離心管中，在650g，室溫條件下離心15min，去除上層淺黃色血漿后，加入與上層淺黃色血漿等體積的生理鹽水，得稀釋的臍血；另取離心管，加入淋巴細胞分離液，并將稀釋的臍血加入到淋巴細胞分離液中，使稀釋的血液與淋巴細胞分離液分層，然后在650g，室溫條件下離心30min，去除部分上清后，吸取中間的白膜層至離心管中，然后加入等體積的生理鹽水，于室溫260g離心10min，去除上清，洗滌三次，并計數(shù)；

其中，淋巴細胞分離液與稀釋的臍血的體積比為15:45～50；

B、單個核細胞的激活：

將上一步去除上清后的沉淀按細胞密度為2.0×10⁶個/mL接種于GT-T551H3無血清培養(yǎng)基，并加入因子，形成混合液；將混合液置于步驟一包被后的T75培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后在溫度為37℃、體積百分含量為5％的CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5d；并在第3d按細胞密度0.8～1.0×10⁶個/mL補液，第5d轉(zhuǎn)袋并按細胞密度0.8～1.0×10⁶個/mL補液；

其中，因子由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21混合而成；且混合液中IL-2的濃度為400～600IU/mL，IL-7的濃度為8～12ng/mL，IL-15的濃度為80～120ng/mL，IL-21的濃度為150～200ng/mL；

此步驟所述的補液為含濃度為400～600IU/mL的IL-2、濃度為8～12ng/mL的IL-7、濃度為40～60ng/mL的IL-15和濃度為80～120ng/mL的IL-21的GT-T551H3無血清培養(yǎng)基；

三、臍血NK細胞的體外擴增

在上一步培養(yǎng)5d后，每隔2d按細胞密度0.8～1.0×10⁶個/mL補液，擴增后，即完成所述的體外擴增臍血NK方法；

此步驟所述的補液為含濃度為400～600IU/mL的IL-2、濃度為8～12ng/mL的IL-7、濃度為40～60ng/mL的IL-15和濃度為80～120ng/mL的IL-21的GT-T551H3無血清培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外擴增臍血NK的方法，其特征在于1mL包被液中包含成分：濃度為5μg/mL的CD16單抗、濃度為1000μg/mL的IFN-γ和濃度為500IU/mL的GM-CSF。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外擴增臍血NK的方法，其特征在于淋巴細胞分離液與稀釋的臍血的體積比為15:50。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外擴增臍血NK的方法，其特征在于因子由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21混合而成；且混合液中IL-2的濃度為500IU/mL，IL-7的濃度為10ng/mL，IL-15的濃度為100ng/mL，IL-21的濃度為180ng/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外擴增臍血NK的方法，其特征在于步驟二補液為含濃度為500IU/mL的IL-2、濃度為10ng/mL的IL-7、濃度為50ng/mL的IL-15和濃度為100ng/mL的IL-21的GT-T551H3無血清培養(yǎng)基。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外擴增臍血NK的方法，其特征在于步驟三補液為含濃度為500IU/mL的IL-2、濃度為10ng/mL的IL-7、濃度為50ng/mL的IL-15和濃度為100ng/mL的IL-21的GT-T551H3無血清培養(yǎng)基。