[發(fā)明專利]植物組織中高效提純病毒雙鏈RNA基因組的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810589528.5
• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN108728432A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳建祥;何夢竹;張?zhí)靹t;傅帥
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12R1/94
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 傅朝棟;張法高

本發(fā)明公開了一種植物組織中高效提純病毒雙鏈RNA基因組的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明克服目前技術(shù)困難，篩選到一種新的高效吸附雙鏈RNA(dsRNA)的纖維素粉—SIGMA公司C6288纖維素粉，并使用開發(fā)的塑料中心過濾柱對纖維素粉進行固定并形成dsRNA過濾純化柱。該方法簡化了實驗操作步驟、降低實驗難度、縮短實驗時間、減少了病毒dsRNA在提取過程中損失和污染，且純化獲得的病毒dsRNA可以用于病毒基因組的測序和群體結(jié)構(gòu)及變異進化分析、更優(yōu)檢測引物的設(shè)計和更優(yōu)分子檢測方法的建立，從而為dsRNA病毒病的致病機制的闡明和準確檢測提供技術(shù)手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種植物組織中高效提純病毒雙鏈RNA基因組的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物病毒中大部分病毒是RNA病毒，尤其是雙鏈RNA(dsRNA)病毒。高濃度、高純度提純dsRNA病毒的雙鏈RNA基因組，是對dsRNA病毒遺傳、變異進行分析的基礎(chǔ)。由于病毒粒子提純困難，且在寄主體內(nèi)含量低、易降解等原因，使從提純病毒粒子中提取病毒基因組dsRNA的方法效率低下。例如，屬于呼腸孤病毒科斐濟病毒屬的水稻黑條矮縮病毒(Riceblack streaked dwarf virus，RBSDV)可侵染水稻、大麥、小麥、玉米、高粱、馬唐、白草和稗草等多種禾本科作物和雜草，引起水稻的黑條矮縮病和玉米的矮縮病。該病毒粒子呈直徑70～75nm的球形，含10條dsRNA病毒基因組。但該病毒粒子含量低且不穩(wěn)定，目前無法從植物組織中分離高質(zhì)量的病毒粒子用于雙鏈RNA的提取。而dsRNA在熱條件下穩(wěn)定，對RNA酶的降解抗性強，所以直接從植物葉片組織中純化雙鏈RNA是一個較好的替代方案。

目前dsRNA提純方法主要有以下幾種：1)是用TRIzol試劑提純動植物組織中的總RNA，然后用DNA酶和RNA酶消化總RNA，除去DNA和單鏈RNA而獲得dsRNA。但這種方法提取dsRNA的質(zhì)量和效率非常低，往往達不到下游基因組分析的要求；2)提取的總RNA用氯化鋰或氯化銫進行密度梯度離心的方法提取純化dsRNA；但這種方法由于提取dsRNA的數(shù)量有限、操作繁瑣、費用昂貴而限制其推廣應(yīng)用3)用纖維素粉吸附dsRNA的純化方法。1966年Franklin等第一次用纖維素粉和一定濃度的乙醇將噬菌體R17的核糖體RNA中分離出dsRNA形式的復(fù)制中間體。作者將細胞破碎后除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，留下總核酸。然后加入將總核酸吸附在纖維素粉上，用含有15％乙醇的STE溶液洗去DNA、核糖體RNA以及單鏈RNA，再用不含乙醇的STE洗脫可以得到dsRNA形式的復(fù)制中間體。Morris和Dodds于1979年用酚和氯仿變性蛋白提取植物和真菌總核酸，然后用纖維素粉吸附成功從感染病毒的植物和真菌中提取出了病毒基因組dsRNA。然而，這些用纖維素粉純化dsRNA的方法因目前該類型的纖維素粉(CF-11)停產(chǎn)而無法再進行，且該純化方法使用纖維素粉提取dsRNA的過程發(fā)生在離心管內(nèi)，需要反復(fù)懸浮、離心纖維素粉后吸除上清的方式去除纖維素粉上吸附的ssRNA和DNA，得到相對純凈的dsRNA。這個過程耗時較長、操作繁瑣、且在反復(fù)懸浮吹打纖維素粉的過程中會損失較多dsRNA，故其純化dsRNA的效率很低。本發(fā)明克服目前技術(shù)困難，篩選到一種新的高效吸附dsRNA纖維素粉--C6288纖維素粉，并使用開發(fā)的制備管對纖維素粉進行固定，通過將纖維素粉固定于制備管中制作為便捷的成品純化柱，再將制備柱套入2mL離心管可以實現(xiàn)吸附dsRNA以及之后清洗純化步驟只要通過離心的方式就可以完成，從而大大簡化了實驗操作步驟、降低實驗難度、縮短實驗時間、減少了dsRNA在提取過程中的損耗。通過使用本方法針對水稻葉片中RBSDV基因組dsRNA進行了提取純化，采用250mg C6288纖維素粉制備的純化柱，提取80mg感染RBSDV的水稻樣品中的dsRNA效果最佳。該提純方法提取到高質(zhì)量的10條RBSDV病毒基因dsRNA，以提純的RBSDV基因組dsRNA為模板用第一至第三代核酸測序技術(shù)進行基因組測序，根據(jù)測序的數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，分析了該病毒的基因組準種結(jié)構(gòu)、遺傳變異，并利用基因組測序數(shù)據(jù)進行RT-PCR和qRT-PCR引物設(shè)計和方法建立，從而為該病毒病的致病機制的闡明和準確檢測提供技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容