[發明專利]一種能夠快速獲得牙鲆穩轉細胞系的載體

在審

• 申請號: 201810587974.2
• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN108728466A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 王旭波;俞海洋;張全啟
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/85;C12N15/88;C12N5/10
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發明提供了一種在牙鲆魚中實現高效穩定轉染的表達載體，本發明載體采用Tol2轉座子，結合編碼合成轉座酶的質粒pCS?TP共轉染能夠顯著提高牙鲆魚細胞整合外源基因的能力。發明載體添加了新霉素抗性篩選標記，從而實現了僅僅依靠傳統的脂質體轉染加抗性篩選的方式，即可獲得較多的重組細胞，極大的提高了牙鲆魚細胞篩選的到穩轉細胞系的效率。發明載體添加了EGFP熒光標簽，能夠方便的示蹤轉入細胞系的外源基因的表達情況。更重要的，本發明載體采用優化后的牙鲆β?actin啟動子替代傳統哺乳動物表達載體中常用的CMV啟動子，創造性的獲得了一種更適應牙鲆魚細胞系外源基因表達的載體，從而實現外源基因在牙鲆魚的各種細胞系中都能夠高效穩定的表達。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種能夠快速獲得牙鲆穩轉細胞系的載體。

背景技術

細胞轉染是將外源分子如RNA、DNA導入細胞的專門技術，現已經成為分子生物學和細胞生物學中研究基因功能常規手段。目前，細胞轉染較為常用的方法有脂質體法、電穿孔法和病毒感染法。電穿孔法依靠瞬時的高脈沖的電壓擊穿細胞膜，從而將外源質粒導入到細胞內，適用范圍廣，但是操作上較為繁瑣，且細胞轉染后致死率較高，轉染所需的細胞和DNA量較大，所以很少在細胞系轉染的過程中適用。病毒感染法通過病毒攜帶DNA侵染細胞，進而將外源基因整合到宿主細胞的基因組上，能夠實現細胞系的穩定轉染，但是適用范圍窄，對魚類細胞系其轉染效率底下，一時間很難篩選到適合魚類細胞系轉染的病毒，且成本較高，實驗流程復雜。脂質體法的原理是通過帶正電的脂質體與細胞膜上帶負點的磷酸基團相互作用，形成復合體，引導外源基因導入細胞內，其適用范圍廣，轉染效率高且操作簡單。

目前，海洋魚類細胞系的轉染大多采用脂質體法實現外源基因的轉染。但是，在利用脂質體法轉染牙鲆魚細胞的過程中仍然遇到以下問題：①外源基因轉入牙鲆魚細胞系后很難整合到細胞基因組DNA上，因而很難靠傳統的脂質體轉染后篩選的方式獲得穩轉染的牙鲆魚細胞系。②成功轉染進入牙鲆細胞的外源基因很難維持高效表達，絕大部分成功轉染的牙鲆魚細胞其外源基因的表達效率會在一周內消失殆盡，明顯低于哺乳動物細胞轉染后外源基因的表達效率。

分析原因主要是：①重組質粒轉入牙鲆細胞后，隨著篩選時間的延長，大部分重組質粒會隨著細胞分裂而逐漸丟失，少部分保留的質粒也很難正確的整合到牙鲆細胞基因組上，這導致很難篩選到穩轉的重組細胞系。②常用的哺乳動物表達載體上的CMV啟動子并不能在牙鲆魚細胞中高效、持久的啟動下游基因的表達，表現為雖然初始啟動效率較高，但隨著時間的延長其啟動效率逐漸降低。

受限于上述原因，長期以來，在利用牙鲆魚的細胞系研究其基因功能的過程中一直采用脂質體瞬時轉染的方式，而無法利用在哺乳動物細胞系中常用的穩轉染方式，從而無法獲得穩定轉染外源基因的牙鲆魚細胞系，極大地限制了在牙鲆中開展基因的調控的功能研究。因此，迫切需要一種高效獲取牙鲆穩轉細胞系的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種能夠快速獲得牙鲆穩轉細胞系的載體，實現將轉染至細胞內的外源基因高效的插入到牙鲆細胞系的基因組DNA中，并能夠實現重組細胞的快速篩選。

本發明所提供的質粒載體，是帶有Tol2轉座子的DNA質粒載體，質粒載體中還攜帶有牙鲆特異性的β‐actin啟動子和新霉素(G418)抗性篩選標記；

所述的牙鲆特異性的β‐actin啟動子，其核苷酸序列為SEQ ID NO:3；

所述的質粒載體，還添加了EGFP熒光標簽。

本發明所提供的質粒，其一種具體的核苷酸序列為SEQ ID NO:1；

本發明再一個方面提供一種轉染牙鲆細胞的方法，是使用上述的質粒載體將外源基因轉染到牙鲆細胞內；

所述的方法，優選與結合編碼合成轉座酶的質粒pCS‐TP進行共轉染；

所述的方法，其一種具體的步驟如下：