[發(fā)明專利]一種肺癌高通量測(cè)序文庫(kù)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810586885.6
• 申請(qǐng)日: 2018-06-08
• 公開（公告）號(hào): CN108753924A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈偉強(qiáng);胡文瑋;史善甫;奚云;葛海鵬;陳悅科
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽鼎晶生物科技有限公司;上海鼎晶生物醫(yī)藥科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6886;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種肺癌高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以肺癌相關(guān)片段為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，得到肺癌初始文庫(kù)；

(2)向裝有所述步驟(1)肺癌初始文庫(kù)的原管中加入0.3～0.7倍PCR反應(yīng)體系體積的磁珠液，反應(yīng)1～30min后，取上清液至新管，棄磁珠；

(3)向所述步驟(2)含有上清液的新管中加入0.7～1.1倍PCR反應(yīng)體系體積的磁珠液，反應(yīng)1～30min后，棄上清液，得到磁珠；

(4)對(duì)所述步驟(3)磁珠進(jìn)行清洗純化，得到純化的肺癌初始文庫(kù)；

(5)對(duì)所述步驟(4)純化的肺癌初始文庫(kù)進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到肺癌測(cè)序文庫(kù)；

(6)向裝有所述步驟(5)肺癌測(cè)序文庫(kù)的原管中加入0.8～1.2倍第二次PCR反應(yīng)體系體積的磁珠液，反應(yīng)1～30min后，棄上清液，得到磁珠；

(7)對(duì)所述步驟(6)磁珠進(jìn)行清洗純化，得到純化磁球；

(8)洗脫所述純化磁珠表面的DNA，得到的洗脫液即為純化的肺癌測(cè)序文庫(kù)；

所述步驟(3)～(8)在同一個(gè)管中操作。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(1)中多重PCR擴(kuò)增包括兩階段：第一階段為RNA擴(kuò)增，所述RNA擴(kuò)增用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～50所示；第二階段為DNA擴(kuò)增，所述DNA擴(kuò)增用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.51～70所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺癌高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，在所述步驟(1)中多重PCR擴(kuò)增時(shí)采用30μl的PCR反應(yīng)體系，所述PCR反應(yīng)體系包括以下含量的組分：10μl的反應(yīng)緩沖液，8μl濃度獨(dú)立為0.9～1.1μmol/L的RNA擴(kuò)增用引物，1μl濃度為10ng/μl的模板和11μl的ddH₂O；所述擴(kuò)增反應(yīng)液包括200U/L聚合酶，100mmol/LpH 8.8的Tris-HCl，500mmol/L的KCl，15mmol/L的MgCl₂和質(zhì)量濃度為0.8％的NP-40。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(1)中的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，3min；95℃，30s，60℃，4min，18個(gè)循環(huán)；72℃，4min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(4)中的清洗用溶劑包括B&W和/或體積比68～72％的乙醇水溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(5)第二次PCR擴(kuò)增中包括上游街頭引物和下游街頭引物，所述上游街頭引物的核苷酸序列如SEQ ID No.71所示；所述下游街頭引物的核苷酸序列如SEQ ID No.72～167所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述構(gòu)建方法，其特征在于，在所述步驟(5)第二次PCR采用30μl的PCR反應(yīng)體系，所述PCR反應(yīng)體系包括10μl反應(yīng)緩沖液，1μl濃度獨(dú)立為10μmol/L的DNA擴(kuò)增用上游街頭引物，1μl濃度獨(dú)立為10μmol/L的DNA擴(kuò)增用下游街頭引物和余量的水；所述反應(yīng)緩沖液包括200U/L聚合酶，100mmol/L pH 8.8的Tris-HCl，500mmol/L的KCl，15mmol/L的MgCl₂和質(zhì)量濃度為0.8％的NP-40。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(5)中第二次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，3min；95℃，15s，58℃，15s，72℃，30s，6～8個(gè)循環(huán)；72℃，5min。

9.權(quán)利要求1～8任意一項(xiàng)所述構(gòu)建方法得到的肺癌高通量測(cè)序文庫(kù)。

10.權(quán)利要求9所述肺癌高通量測(cè)序文庫(kù)在體外定性檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的石蠟包埋組織切片中EGFR、BRAF、PIK3CA、KRAS、NRAS、ALK、ROS1基因的變異中的應(yīng)用。