[發(fā)明專利]一種一步法同時(shí)檢測(cè)miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810586721.3
• 申請(qǐng)日: 2018-06-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108982439A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 季晨博;郭錫熔;馬潔樺;崔縣偉;文娟;尤梁惠;曹彥;李沄;王興;許鵬飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京市婦幼保健院
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 南京禾易知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32320
• 代理人: 徐莉芳

1.一種miR-486、miR-146b和miR-15b探針設(shè)計(jì)方法，其特征在于：所述具體方法步驟如下：

步驟一：設(shè)計(jì)莖環(huán)-miR-486序列為SH-(CH2)6-AAA AAC TCG GGG CAG CTC AGT ACAGGA TTT TT-6-FAM，莖環(huán)-miR-146b序列為SH-(CH2)6-AAA AAC AGC CTA TGG AAT TCA GTTCTC ATT TTT-Cy5，莖環(huán)-miR-15b序列為SH-(CH2)6-AAA AAT GTA AAC CAT GAT GTG CTGCTA TTT TT-Cy3；

步驟二：步驟一中的三種莖環(huán)結(jié)構(gòu)3′端修飾了不同熒光分子，F(xiàn)AM修飾莖環(huán)-miR-486，Cy5修飾莖環(huán)-miR-146b，Cy3修飾莖環(huán)-miR-15b，5′端通過(guò)金-巰鍵修飾到金納米表面。

2.一種探針修飾AuNPs的方法，其特征在于：所述具體修飾步驟如下：

步驟一：取粒徑為50nm的100μL AuNPs，加入TCEP、莖環(huán)-miR-486、莖環(huán)-miR-146b和莖環(huán)-miR-15b；

步驟二：室溫下孵育，冷藏備用，TCEP終濃度為1mM，三種莖環(huán)的終濃度為0.5μM。

3.一種同時(shí)檢測(cè)miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其應(yīng)用，其特征在于：所述具體操作步驟如下：

步驟一：AuNPs功能化修飾，加適量TM緩沖液分別溶解合成的三種miRNA探針至100μM的終濃度，再取適量TM緩沖液分別稀釋三種miRNA探針至10μM，置于95℃金屬浴熱擊10分鐘，然后迅速置于4℃，取粒徑為50nm的100μL AuNPs，加入TCEP、莖環(huán)-miR-486、莖環(huán)-miR-146b和莖環(huán)-miR-15b，室溫下孵育，冷藏備用，TCEP終濃度為1mM，三種莖環(huán)的終濃度為0.5μM；

步驟二：濃度梯度測(cè)定，取經(jīng)步驟一中修飾過(guò)的AuNPs，加入濃度范圍為1pM-100nM的miR-486、miR-146b和miR-15b，然后室溫孵育，進(jìn)行三種熒光強(qiáng)度檢測(cè)，熒光測(cè)量均由F2500熒光光譜儀實(shí)現(xiàn)，各熒光分子的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)如下：6-FAM為495nm和521nm，Cy3為550nm和570nm，Cy5為649nm和670nm，6-FAM在495nm處激發(fā)，Cy3的激發(fā)光為550nm，Cy5為649nm，在521nm處測(cè)量6-FAM熒光信號(hào)，570nm處檢測(cè)Cy3熒光信號(hào)，670nm處檢測(cè)Cy5熒光信號(hào)，所有激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5nm，PMT電壓為800V，所有這些檢測(cè)都記錄在室溫下，最后得到熒光強(qiáng)度與miRNA濃度的線性關(guān)系；

步驟三：利用步驟二所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行分析檢測(cè)，分析miR-486、miR-146b和miR-15b的含量；

步驟四：將步驟三中同時(shí)檢測(cè)miR-486、miR-146b和miR-15b的方法應(yīng)用于肥胖兒童血液中miR-486、miR-146b和miR-15b的檢測(cè)，預(yù)示未來(lái)患成人T2D風(fēng)險(xiǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種探針修飾AuNPs的方法，其特征在于：所述步驟二中室溫孵育時(shí)間為1.5h，冷藏備用溫度為4℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種同時(shí)檢測(cè)miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其應(yīng)用，其特征在于：所述步驟一中室溫孵育時(shí)間為1.5h，冷藏備用溫度為4℃，所述步驟二中室溫孵育時(shí)間為10min。