[發(fā)明專利]一種細(xì)菌移植入消化道后對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810585542.8
• 申請(qǐng)日: 2018-06-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108753904B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊朝勇;王煒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04
• 代理公司: 上海衡方知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31234
• 代理人: 周世亮

本發(fā)明涉及一種移植入消化道的細(xì)菌的活性評(píng)價(jià)方法，其包括，將移植前的植入菌帶有A基團(tuán)標(biāo)記物；移植入消化道內(nèi)一段時(shí)間之后，利用帶有B基團(tuán)的標(biāo)記物體內(nèi)代謝標(biāo)記處理接受植入菌后的受體腸道菌群，以檢測(cè)菌群同時(shí)帶有A基團(tuán)標(biāo)記和B基團(tuán)標(biāo)記的細(xì)菌，和僅帶有A基團(tuán)標(biāo)記和B基團(tuán)標(biāo)記的其中一個(gè)的細(xì)菌。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細(xì)菌移植入消化道后對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法，尤其是涉及采用雙重標(biāo)記對(duì)移植入消化道的細(xì)菌的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。

背景技術(shù)

針對(duì)外源的細(xì)菌植入宿主腸道后的追蹤問(wèn)題，可以采取在體外培養(yǎng)特定細(xì)菌時(shí)進(jìn)行非天然糖代謝標(biāo)記、偶聯(lián)熒光基團(tuán)并使用的方法再將其通過(guò)灌胃等方式植入宿主體內(nèi)，使用其帶有的熒光基團(tuán)進(jìn)行示蹤，如文獻(xiàn)Nature Medicine.21，1091–1100(2015)。另外，也有報(bào)道也可以通過(guò)使用非天然糖或者非天然的D-型氨基酸(丙氨酸)對(duì)宿主進(jìn)行灌胃的方式對(duì)其體內(nèi)的腸道菌群進(jìn)行代謝標(biāo)記，如文獻(xiàn)Biochemistry.56,3889-3893(2017)和Nat.Microbiol.2,17099(2017)。D-型丙氨酸是在細(xì)菌肽聚糖(peptidoglycan)中的五肽結(jié)構(gòu)末端高度保守的一種特殊氨基酸，細(xì)菌在肽聚糖的合成和代謝過(guò)程中會(huì)在這一位置通過(guò)青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins PBPs)中的轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行肽段交聯(lián)(與鄰近的肽段)、水解(去掉最末端的D-丙氨酸)、替換(與周圍環(huán)境中的其他D-aminoacid，DAA)等修飾。之前人們發(fā)現(xiàn)，某些青霉素結(jié)合蛋白對(duì)D-型丙氨酸側(cè)鏈上帶有的修飾基團(tuán)有很高的容忍性，人們利用這一特點(diǎn)，將側(cè)鏈上帶有各種熒光基團(tuán)的DAA探針通過(guò)代謝標(biāo)記的方式標(biāo)記到各種細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)上。由于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，因此保證了DAA探針對(duì)細(xì)菌的高選擇性，且由于肽聚糖的高周轉(zhuǎn)(turnover)速率，導(dǎo)致DAA探針的標(biāo)記非常迅速，且能實(shí)現(xiàn)很高的標(biāo)記強(qiáng)度。

目前存在的可以對(duì)細(xì)菌移植后的菌株存活情況進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法，是通過(guò)對(duì)移植前后的糞便樣品進(jìn)行深度的細(xì)菌DNA測(cè)序并結(jié)合復(fù)雜的生物信息學(xué)分析以得到移植菌是否存活的信息，如文獻(xiàn)Microbiome.5,50(2017)、Cell HostMicrobe.23,229–240(2018)、Science.352,586-589(2016)和專利CN20148004928X。

對(duì)菌群移植后的植入菌追蹤與活性評(píng)價(jià)問(wèn)題，一直以來(lái)缺乏有效的研究手段，直到2016年才有了首次報(bào)道，通過(guò)糞便樣品深度16s RNA測(cè)序并結(jié)合生物信息學(xué)手段分析可以區(qū)分出菌株是來(lái)自植入菌還是原有菌群，如文獻(xiàn)Science.352,586-589(2016)。但存在測(cè)序技術(shù)復(fù)雜、成本高、數(shù)據(jù)分析難度大等問(wèn)題。對(duì)益生菌的活性評(píng)價(jià)這一問(wèn)題，現(xiàn)有方法只能通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型或者人體實(shí)驗(yàn)后的糞便進(jìn)行傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，或應(yīng)用分子生物學(xué)的手段如16S rRNA測(cè)序、熒光原位雜交等方法進(jìn)行分析。其中，培養(yǎng)計(jì)數(shù)法無(wú)法對(duì)難以培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行分析；基于核酸的檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分死細(xì)菌與活細(xì)菌，因此對(duì)植入菌的活性狀況尚無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。

發(fā)明內(nèi)容

基于目前上述的問(wèn)題，本發(fā)明提供了通過(guò)雙重標(biāo)記對(duì)移植入消化道的細(xì)菌的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。

本發(fā)明一方面涉及移植入消化道的細(xì)菌的活性評(píng)價(jià)方法，其包括，將移植前的植入菌帶有A基團(tuán)標(biāo)記物；移植入消化道內(nèi)一段時(shí)間之后，利用B基團(tuán)標(biāo)記物體內(nèi)代謝標(biāo)記接受植入菌后的受體腸道菌群，以檢測(cè)同時(shí)帶有A基團(tuán)標(biāo)記和B基團(tuán)標(biāo)記的細(xì)菌，和僅帶有A基團(tuán)標(biāo)記和B基團(tuán)標(biāo)記的其中一個(gè)的細(xì)菌。

另一方面，如上的方法包括分析菌群同時(shí)帶有A基團(tuán)標(biāo)記和B基團(tuán)標(biāo)記和僅帶有A基團(tuán)標(biāo)記或B基團(tuán)標(biāo)記的菌體比例，進(jìn)一步地，包括分離同時(shí)帶有A基團(tuán)標(biāo)記和B基團(tuán)標(biāo)記的菌體，通過(guò)16s DNA測(cè)序得到其種屬信息和種屬比例。

本發(fā)明還涉及用于評(píng)價(jià)移植入消化道的細(xì)菌活性的試劑盒，其包含標(biāo)記植入菌的A基團(tuán)標(biāo)記物和B基團(tuán)的標(biāo)記物，和/或輔劑、稀釋液、緩沖液或載體。

附圖說(shuō)明