[發明專利]一種用于肝癌檢測的基因集及其panel檢測設計方法

有效

• 申請號: 201810584350.5
• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN108753967B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發明（設計）人: 周儉;樊嘉;安娜;于競;楊欣榮;陽作權;王向東;林木飛;黃傲;謝穎;朱師達;吳逵
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院;深圳華大生命科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

1.一種肝癌基因檢測panel的制備方法，包括如下步驟：

1）、篩選肝癌相關基因，建立本地數據庫：分別收集同一肝癌患者的配對樣本，所述配對樣本為實體瘤組織樣本與血細胞或者癌旁組織樣本配對，采用NGS測序技術分別對配對樣本進行基因檢測，通過分析比較，選擇突變頻率≥5%的基因區域，通過perl腳本流程對各種數據進行錄入，標準化過濾處理，最后輸出備選gene列表；

2）、從已公開文獻資源中選擇已公開肝癌相關基因，所述已公開肝癌相關基因包括：公共數據庫中的高頻突變基因，應用標準、治療指南、藥物標簽及通用數據庫中的肝癌治療相關基因，已公開文獻中報道的與肝癌分子分型、治療、預后、誘發相關的基因；

3）、將上述肝癌相關基因合并，去冗余，并通過NCBI office name或HGNC approvedOfficial Symbol系統確定標準基因名，獲得肝癌檢測芯片基因集；

4）、選擇用于探針設計的基因目標區域：對于步驟1）和步驟2）中收集的基因，如果明確具體變異位置，則根據已明確的基因位點覆蓋區域來選擇目標區域；對于位置較集中或密集的基因區域，則選擇外顯子作為目標區域；對于與肝癌高度相關的重要基因，則選擇全部可變剪切類型的區域作為目標區域；

5）、將步驟4）中選擇的基因目標區域向兩端延伸，長度為50bp，合并全部選擇區域后去冗余，最終形成探針設計的bed文件，該bed文件包含目標區域的染色體編號、目標區域的起始位置、目標區域的終止位置、自定義信息；

6）、panel探針設計：根據步驟5）所形成的bed文件中各目標區域的位置信息，從人類基因組中可設計探針數據集中尋找可以設計探針的設計區域，根據設計區域和探針設計參數生成探針，其中所述可設計探針數據集是將基因組的Alu重復區域、串聯重復區域、假基因中重復度高或者組裝質量低的區域剔除之后形成的可以進行捕獲探針設計的數據集；

7）、探針設計評估：將篩選出的與肝癌高度相關的重要位點及全部目標區域與步驟6）中選擇的探針設計區域進行比對，計算探針覆蓋所述重要位點的覆蓋度和全部目標區域的覆蓋度，計算公式為：覆蓋度=比對上的讀長數/目標測序讀長數，如果符合全部目標區域覆蓋度≥90%、重要位點覆蓋度≥99%的覆蓋需求，則可進入下一步panel合成；如不合格，則需在目標區域附近選擇合適探針；

8）、panel合成：在步驟7）中設計的探針兩端添加固定的擴增序列，合成DNA單鏈，PCR擴增，轉錄成RNA探針，添加生物素標記，得到肝癌基因檢測panel。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述公共數據庫中的高頻突變基因的收集是通過對公共數據庫中檢測肝癌患者的檢測數據進行過濾，選擇高頻突變基因，篩選方法為下載TCGA、COSMIC數據庫，對肝癌患者的基因突變頻率進行計算，排序后過濾，選擇前20個基因；以同樣的方法，在ICGC數據庫中選出肝癌樣本的檢測數據，包含LIRI-JP、LINV-JP、LIHC-US、LICA-FR、LIHM-FR五部分數據，計算基因的突變頻率，排序后過濾，選擇前20個基因。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述應用標準、治療指南、藥物標簽及通用數據庫中的肝癌治療相關基因的收集是從數據庫PGKB、NCCN、US. FDA drug、CFDA，應用標準，治療指南，藥物標簽中收集肝癌治療相關基因。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述已公開文獻中報道的基因的收集是通過現有技術文本挖掘篩選出文獻中的重要基因，文本挖掘的關鍵參數包含癌癥類型、發病機制、癌癥風險、預后、檢測方法、分子檢測類型、治療方法，通過關鍵詞建立詞庫，并選擇關鍵詞之間的“和/或”聯系，通過腳本對NCBI Pubmed文獻進行挖掘，最終從文本挖掘的選出文獻中篩選出與肝癌分子分型、治療、預后、誘發相關的重要基因。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟8）中的所述RNA探針為單鏈RNA探針。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝癌基因檢測panel固定在基因芯片的硅片或玻片上；或者采用液相反應池，RNA單鏈探針不固定在固相載體上。