[發明專利]牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌衛星細胞增殖分化調控中的應用和驗證方法

有效

• 申請號: 201810579627.5
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108753779B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 劉新峰;郭宏;丁向彬;李新;張林林;李燕
• 申請（專利權）人: 天津農學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N5/10;C12N5/077;C12Q1/6888;G01N33/68
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種牛lncRNA-133a，其特征在于：所述牛lncRNA-133a的核苷酸序列為SEQ1。

2.如權利要求1所述的牛lncRNA-133a在促進牛骨骼肌衛星細胞增殖和成肌分化的應用。

3.根據權利要求2所述的牛lncRNA-133a在促進牛骨骼肌衛星細胞增殖和成肌分化的應用，其特征在于：所述應用為在促進牛骨骼肌衛星細胞成肌分化中的應用。

4.根據權利要求2所述的牛lncRNA-133a在促進牛骨骼肌衛星細胞增殖和成肌分化的應用，其特征在于：所述應用為在促進牛骨骼肌衛星細胞增殖中的應用。

5.如權利要求2所述的牛lncRNA-133a在促進牛骨骼肌衛星細胞增殖和成肌分化的應用的檢測方法，其特征在于：步驟如下：

⑴ 在lncRNA-133a骨骼肌衛星細胞中轉染lncRNA-133a真核細胞表達質粒，實現細胞內lncRNA-133a的過表達，設置對照組，誘導牛骨骼肌衛星細胞向成肌方向分化2天；收集細胞，檢測對照組及實驗組的骨骼肌衛星細胞分化標志基因MHC、MyoD和MyoG表達水平；

⑵ 在lncRNA-133a骨骼肌衛星細胞中轉染lncRNA-133a真核細胞表達質粒，實現細胞內lncRNA-133a的過表達，設置對照組，轉染后24h，即細胞增殖期，進行EdU細胞增殖檢測牛骨骼肌衛星細胞增殖數；

當實驗組過表達lncRNA-133a后，增殖細胞數顯著高于對照組、實驗組的MHC、MyoD和MyoG的表達水平顯著高于對照組相時，則證明牛lncRNA-133a序列能夠促進牛骨骼肌衛星細胞的增殖和分化。

6.根據權利要求5所述的牛lncRNA-133a在促進牛骨骼肌衛星細胞增殖和成肌分化的應用的檢測方法，其特征在于：所述真核細胞表達質粒為pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a，所述對照組為以空質粒pCDNA3.1-EGFP轉染牛骨骼肌衛星細胞；

利用qRT-PCR及Western blotting檢測對照組及實驗組的牛骨骼肌衛星細胞分化標志基因表達水平。

7.根據權利要求6所述的牛lncRNA-133a在促進牛骨骼肌衛星細胞增殖和成肌分化的應用的檢測方法，其特征在于：具體步驟如下：

⑴ 細胞培養

常規復蘇凍存的原代牛骨骼肌衛星細胞，加入增殖培養基中并置于37℃、5% CO₂、飽和濕度培養箱中培養，該增殖培養基為含體積分數20%的胎牛血清、100 IU·mL^-1青霉素和鏈霉素的DMEM，待增殖細胞融合度達80-90%時更換分化培養基，該分化培養基為含體積分數2%馬血清的DMEM；

⑵ 牛骨骼肌衛星細胞轉染

增殖期細胞融合度達50%時，利用脂質體轉染試劑轉染pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a，為實驗組，以空質粒pCDNA3.1-EGFP轉染細胞作為對照組，轉染后24h時，即細胞增殖期，增殖培養基更換為分化培養基，誘導牛骨骼肌衛星細胞向成肌方向分化2天；

⑶ 牛骨骼肌衛星細胞增殖、分化能力的檢測

EdU細胞增殖檢測：細胞在轉染后24小時, 即增殖期細胞，檢測實驗組和對照組細胞的增殖情況；

⑷ 牛骨骼肌衛星細胞中分化標記因子表達水平的檢測

① mRNA水平檢測：在誘導牛骨骼肌衛星細胞向成肌方向分化2天時，即DM2期，收集實驗組和對照組細胞，Trizol裂解并提取總RNA,取4μg總RNA反轉錄為cDNA，采用qRT-PCR法檢測各分化標記因子基因MHC、MYOD、MYOG的表達；

qRT-PCR反應體系為20μL：0.5 μL上游引物F、0.5 μL下游引物R、2.0 μL 5×稀釋cDNA、10 μL 2×All-in-OneTMqPCR Mix、7.0 μL RNase free water；反應條件：95℃ 10min；95℃ 10s、60℃ 20s、72℃ 15s，重復40個循環；

② 蛋白水平檢測：細胞在DM2期時被蛋白裂解液裂解，收集蛋白，通過Westernblotting檢測分化標志基因MHC的蛋白表達。