[發(fā)明專利]在微流控芯片中捕獲和鑒定胎兒有核紅細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810578067.1
• 申請(qǐng)日: 2018-06-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108753573A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙興中;魏小云;蔡博
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12M1/00
• 分類號(hào): C12M1/00;C12N5/00;G01N33/569
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 俞琳娟

本發(fā)明提供一種在微流控芯片中捕獲和鑒定胎兒有核紅細(xì)胞的方法，包括：步驟1.采用兩步去溶劑法合成明膠納米顆粒并制備成前驅(qū)液，然后通入微流控芯片，在其內(nèi)壁形成納米涂層，其中微流控芯片包含多條蛇形主溝道和多個(gè)魚(yú)骨單元；步驟2.利用化學(xué)修飾方法在納米涂層上修飾上鏈酶親和素，然后嫁接生物素修飾的抗體；步驟3.利用密度梯度離心法，從外周血中分離出含有胎兒有核紅細(xì)胞的單核細(xì)胞層；步驟4.將單核細(xì)胞懸液以一定流速通入微流控芯片進(jìn)行捕獲；步驟5.將一定濃度的明膠酶通入到捕獲有胎兒有核紅細(xì)胞的微流控芯片中，通過(guò)降解納米涂層釋放胎兒有核紅細(xì)胞；步驟6.利用特異性抗體對(duì)捕獲到的胎兒有核紅細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于胎兒細(xì)胞分選和鑒定方法領(lǐng)域，具體涉及一種在微流控芯片中捕獲和鑒定胎兒有核紅細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

胎兒細(xì)胞在孕婦妊娠期間，可以通過(guò)胎盤(pán)屏障進(jìn)入母體外周血液。胎兒細(xì)胞具有多種特征：①屬于單核細(xì)胞，包含有胎兒的全部遺傳信息；②表面具有區(qū)別于正常血細(xì)胞的特異性蛋白；③在孕婦外周血中循環(huán)周期短，用于診斷時(shí)不受前次妊娠影響。胎兒細(xì)胞的特殊性質(zhì)為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了新的思路，許多研究都致力于胎兒細(xì)胞的富集。由于胎兒細(xì)胞在孕婦外周血中的數(shù)量極少，對(duì)于它們的高效率分選一直是一個(gè)技術(shù)難題。

傳統(tǒng)的細(xì)胞分選技術(shù)有磁分選法和流式細(xì)胞術(shù)。磁分選技術(shù)是基于外加磁場(chǎng)的作用，利用特異性抗體標(biāo)記的磁性微粒將靶細(xì)胞分離出來(lái)。該方法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短，但存在分選純度不高的問(wèn)題。流式細(xì)胞術(shù)使用的設(shè)備昂貴，且需專業(yè)人員操作，同時(shí)對(duì)細(xì)胞用量有所要求，因而限制了其在實(shí)驗(yàn)室的普及推廣。近年來(lái)，利用微流控芯片結(jié)合三維納米材料捕獲稀有細(xì)胞的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。微流控技術(shù)主要是將樣品預(yù)處理、樣品操控、樣品反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè)等功能集成在一塊微型芯片上，以實(shí)現(xiàn)便攜、快速、實(shí)時(shí)高效的檢測(cè)與分析。三維納米材料因其特殊的尺寸和結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出小尺寸效應(yīng)、高比表面積等特性，可增大待測(cè)細(xì)胞與靶點(diǎn)的接觸幾率，同時(shí)，納米材料的粗糙表面可降低靜電力從而減少排斥作用，可增大靶細(xì)胞的粘附性，大大提高待測(cè)細(xì)胞的富集效率。將納米材料修飾到微流控芯片溝道內(nèi)壁，大大增強(qiáng)芯片對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的吸附能力，表現(xiàn)出高效的捕獲能力。

此外，由于孕婦自身的有核紅細(xì)胞會(huì)表達(dá)γ珠蛋白，傳統(tǒng)的利用帶有熒光基團(tuán)的γ珠蛋白抗體無(wú)法判別有核紅細(xì)胞的胎源性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決上述問(wèn)題而進(jìn)行的，目的在于提供一種高效、高特異性的在微流控芯片中捕獲和鑒定孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞的方法。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用了以下方案。

本發(fā)明提供一種在微流控芯片中捕獲和鑒定胎兒有核紅細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1.采用兩步去溶劑法合成明膠納米顆粒并制備成前驅(qū)液，將前驅(qū)液通入微流控芯片，在該微流控芯片的溝道內(nèi)壁形成納米涂層，其中，微流控芯片包含：多條蛇形主溝道(蛇形溝道)，和設(shè)置在蛇形主溝道上方、沿著流向排列的多個(gè)魚(yú)骨單元，每個(gè)魚(yú)骨單元都沿著蛇形主溝道寬度方向延伸、并且呈L形；步驟2.利用化學(xué)修飾方法在納米涂層上修飾上鏈酶親和素，然后嫁接生物素修飾的抗體；步驟3.利用密度梯度離心法，從外周血中分離出含有胎兒有核紅細(xì)胞的單核細(xì)胞層；步驟4.將單核細(xì)胞懸液以一定流速0.4～1.6mL/h通入微流控芯片進(jìn)行捕獲；步驟5.將一定濃度的明膠酶通入到捕獲有胎兒有核紅細(xì)胞的微流控芯片中，通過(guò)降解納米涂層釋放胎兒有核紅細(xì)胞；以及步驟6.利用特異性抗體對(duì)捕獲到的胎兒有核紅細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

優(yōu)選地，在本發(fā)明所涉及的在微流控芯片中捕獲和鑒定胎兒有核紅細(xì)胞的方法中，還可以具有這樣的特征：微流控芯片的進(jìn)口端至出口端的長(zhǎng)度為35mm，每條蛇形主溝道的入流端和出流端之間的距離為22mm，這樣設(shè)置效果更好。