[發明專利]朱鹮微衛星多態位點、鑒定方法及特異引物序列

有效

• 申請號: 201810578019.2
• 申請日: 2018-06-05
• 公開（公告）號: CN108588239B
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發明（設計）人: 方盛國;萬秋紅;孫力;夏金全
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發明提供了一種朱鹮微衛星多態位點、鑒定方法及特異引物序列。篩選出的12對朱鹮微衛星多態位點特異引物序列，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24所示。鑒定朱鹮微衛星多態位點的方法利用朱鹮基因組篩選出微衛星位點并設計高質量引物；將朱鹮基因組測序read數據比對到朱鹮參考基因組鑒定INDEL位點；根據INDEL位點和微衛星位點信息，篩選出具有多態性的微衛星位點及高質量引物。本發明所提供的12對微衛星引物，均為多態性位點，具有較強的分辨能力。利用這套微衛星引物，可經濟、快速、正確地進行朱鹮個體鑒定和親子關系鑒定，有助于對朱鹮種群進行家族譜系重建和信息完善，為制定科學的朱鹮保護方案提供數據支持。

技術領域

本發明屬于朱鹮微衛星多態位點鑒定領域，具體涉及朱鹮微衛星多態位點、鑒定方法及特異引物序列。

背景技術

微衛星指DNA短串聯重復序列(simple sequence repeat,SSR)，由核心序列與兩側的側翼序列構成。核心序列室2-6個核苷酸，通常微衛星核心序列的重復數與該位點的等位基因數有很強的正相關，核心序列重復數越大，其變異性越大，則該微衛星微點的等位基因數目就越多。微衛星具有數量多，在基因組內分布均勻，多態性信息豐富，易于檢測等特點，在單個微衛星位點上可做共顯性的等位基因分析。目前微衛星技術已經被作為優良的遺傳標記而得到廣泛應用。同時，隨著DNA提取技術的不斷提高，以微量DNA材料為標本開展的相關研究越來越受到人們的重視。以PCR為基礎的微衛星分析，其最大優點是對模板DNA的要求較低，納克量或部分斷裂的DNA都能得到有效的分析，因此微衛星標記越來越多的應用于那些缺乏遺傳關系信息的瀕危動物的研究。近年來，隨著對瀕危動物保護遺傳學研究的日益重視和加強，微衛星分子標記已被用來解釋瀕危物種的進化歷史、種群遺傳結構分析、輔助種群調查、親緣關系鑒定和近緣物種及雜交個體鑒別等保護生物學所特別關注的論題。這些研究所得的遺傳數據提供了制定物種保護的可靠依據，證實了微衛星分子標記在保護遺傳學研究中所占據的重要位置。

然而，雖然微衛星分子標記因其眾多優點而在瀕危動物遺傳保護研究中得到越來越多的應用，并極大地提高了保護工作的有效性。但微衛星分子標記在使用上仍有不足之處。例如，雖然有研究發現微衛星DNA側翼序列在近緣物種間具有一定的保守性，然而對一些珍稀物種，當缺乏相關近緣物種微衛星序列信息參考的情況下，則需要進行微衛星微點的篩選和特異引物的開發。而且，瀕危物種普遍具有較低的遺傳多樣性，因此獲得多態性的微衛星位點顯得更困難而且更重要。

朱鹮，世界瀕危物種及國家一級重點保護動物，隸屬鳥綱鵜形目鹮科朱鹮屬，是一種中等體型的涉禽，曾經廣泛分布于東亞的中國、俄羅斯遠東地區、朝鮮半島和日本等地。19世紀末20世紀初，由于人類活動等原因朱鹮種群數量大幅減少，俄羅斯、朝鮮半島和日本的野生個體相繼絕跡，直到1981年科研人員在我國陜西省洋縣秦嶺山中重新發現了7只野生朱鹮，這7只個體也成為了當前全球范圍內所有已知個體的奠基者。但是，目前這些朱鹮的遺傳多樣性如何？野生種群與圈養種群之間是否產生了遺傳分化？人工種群的繁殖策略是否合理？采用什么樣的繁殖策略才能最大限度地保護人工種群的遺傳多樣性？能否對部分圈養種群進行野外放歸等問題仍然不得而知，這在

一定程度上限制了物種完善的保護策略與保護計劃的制定。

因此，鑒定朱鹮微衛星多態位點，篩選朱鹮微衛星特異引物，才能針對上述的一些問題開展研究，為政府主管部門制定朱鹮的保護和管理策略提供科學依據。幸運的是，越來越多的物種的參考基因組已經完成測序并發布，這為我們在全基因組水平上大批量得獲取微衛星數據提供方便。前人使用物種參考基因組篩選微衛星的方法，存在兩方面的缺陷：1、引物設計特異性較差，容易產生非特異性擴增；2、篩選的位點多態性較低,后續需要花費較多的時間和成本進行進一步篩選。本發明利用已經公開的朱鹮參考基因組序列，通過多輪比對篩選，確保引物具有較高特異性；同時使用結合可公開獲取的基因組測序原始序列進行比對篩選，使用一個個體的基因組數據，便可獲得多態性更高的朱鹮微衛星位點信息并設計特異引物。

發明內容