[發(fā)明專利]一種牛乳中乳過氧化物酶的純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810575168.3
• 申請日: 2018-06-06
• 公開（公告）號: CN108676784B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發(fā)明（設計）人: 王加啟;張養(yǎng)東;鄭楠;李松勵;趙圣國
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞;謝怡婷

一種牛乳中乳過氧化物酶的純化方法。本發(fā)明采用瓊脂糖凝膠疏水層析柱一步疏水層析法純化液態(tài)乳中的乳過氧化物酶，相比現(xiàn)有技術省略了多步驟、復雜的提取純化步驟，具有快速、高效、低成本的優(yōu)點，且純化得到的乳過氧化物酶純度大于等于90％，蛋白溶解于pH＝7.0的洗脫緩沖液中，無需去除硫酸銨即可用于后續(xù)實驗或操作。

技術領域

本發(fā)明涉及一種液態(tài)乳(例如牛乳)中乳過氧化物酶的快速純化方法，更具體地說是采用快速蛋白純化層析技術，經(jīng)一步疏水層析純化液態(tài)乳中乳過氧化物酶，屬于蛋白純化技術領域。

背景技術

乳過氧化物酶(lactoperoxidase,LPO,EC 1.11.1.7)作為乳液中的內(nèi)源酶之一，廣泛存在于哺乳動物的乳腺、唾液腺、淚腺及其各自分泌物(乳、唾液、眼淚)中。LPO有較高的熱穩(wěn)定性，可作為超巴氏殺菌的評定指標之一。LPO是一種有效的抗菌劑，不僅可以用來減少奶及奶制品中的細菌菌群，通過添加過氧化氫和硫氰酸鹽來活化乳過氧化物酶體系(LPOS)延長冷凍原料乳的保存期限，還可以在保存食品，化妝品和滴眼液中有著廣泛的應用。同時，LPO已經(jīng)在牙科和傷口治療中得到應用，適用于治療牙齦炎和牙周病等；牙膏或漱口水中加入LPO可以殺死口腔細菌，并減少由這些細菌產(chǎn)生的酸。此外，LPO在醫(yī)學上可以用作抗腫瘤和抗病毒劑。

開發(fā)LPO的最大問題是其分離過程煩瑣、純化困難、制造成本較高，難以實現(xiàn)商業(yè)化，所以使用不同的分離純化技術來提取LPO一直是許多研究的重點，探索操作簡單方便、純化快速、成本低、效率高、開發(fā)潛力大的新型分離提純方法是今后要努力發(fā)展的方向。目前已有研究用不同的純化方法來提取LPO，如CM-Sephadex離子交換色譜法、Sephadex g-100凝膠過濾色譜法、苯基-瓊脂糖疏水親和層析、Toyopearl-SP陽離子交換層析法等。然而這些研究的純化方法由于一般至少使用兩種不同的交換柱，操作比較復雜、耗時長、成本高。目前還有一些方法可以分離LPO，但操作方法更加繁瑣，如分離純化LPO可在粗制凝乳酶乳清中添加1.9～2.5mol·L^-1(NH₄)₂SO₄鹽析出來，接著通過磷酸鈣凝膠色譜，在二氧化硅方解石凝膠中可進一步純化，最后從4mol·L^-1K₂HPO₄中結晶析出。

顯然，還需要更多的、更快捷的分離和純化LPO的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了改善現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種液態(tài)乳中乳過氧化物酶的純化方法，主要用于從生乳中提取純化乳過氧化物酶，具有生物學活性的乳過氧化物酶蛋白經(jīng)一步疏水層析即可獲得，且蛋白純度≥90％。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術方案：

一種液態(tài)乳中乳過氧化物酶的純化方法，其特征在于，使用瓊脂糖凝膠疏水層析柱對硫酸銨乳清溶液進行疏水層析，分離純化得到乳過氧化物酶，非必要地，可進一步純化得到純度更高的乳過氧化物酶。

所述液態(tài)乳為人或哺乳動物的乳汁，例如，人乳、羊乳、牛乳、馬乳、駱駝乳或其它動物乳，優(yōu)選牛乳。

所述瓊脂糖凝膠疏水層析柱可以為預裝柱，選自丁基-瓊脂糖凝膠疏水層析柱(如Butyl Sepharose 4FF預裝柱、Butyl-S Sepharose 6FF預裝柱)、苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析柱(如Phenyl Sepharose 6FF(LS)預裝柱、Phenyl Sepharose 6FF(HS)預裝柱)和辛基-瓊脂糖凝膠疏水層析柱(如Octyl Sepharose FF預裝柱)，特別優(yōu)選為辛基-瓊脂糖凝膠4FF(如Octyl Sepharose 4FF預裝柱)疏水層析柱。