[發明專利]一種熱穩定性提高的新瓊二糖水解酶

有效

• 申請號: 201810572994.2
• 申請日: 2018-06-06
• 公開（公告）號: CN108715839B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 毛相朝;王其東;孫建安;劉振;黃文燦;張斌
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12P19/02;C12P19/14
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明的目的是提供一種熱穩定性提高的新瓊二糖水解酶，該新瓊二糖水解酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:3。本發明所提供的熱穩定性提高的新瓊二糖水解酶，相比較原始酶而言，該突變子的最適溫度提高了3℃，半衰溫度提高了2.5℃，半衰期t1/2也有了顯著提高，其熱穩定性顯著增強，在40℃保溫40min仍然能夠水解底物新瓊二糖，且該突變子的酶活較原始酶提高了約15％。

技術領域

本發明屬于酶改造技術領域，具體涉及一種熱穩定性提高的新瓊二糖水解酶。

背景技術

新瓊二糖水解酶是一類能夠水解新瓊二糖或新瓊寡糖生成單糖和瓊寡糖的酶，對微生物的新陳代謝具有重要意義。其水解產物3,6-內醚-L-半乳糖(L-AHG)生理活性多樣，在醫藥、生物領域都有巨大的應用價值。研究表明，在許多領域，奇數型瓊寡糖的性質顯著優于新瓊寡糖，因此對新瓊二糖水解酶的研究打破了目前瓊寡糖無法工業化生產的困境。

溫度是酶催化反應中的重要影響因素，在一定范圍內隨著溫度的升高反應速率加快，但過高的溫度會降低酶的活性甚至使酶失活。酶的熱穩定性是指酶經過一定溫度的孵育還能保存的酶活性。雖然自然界中存在嗜熱菌，但數量極少，無法實現工業上的要求。提高酶的熱穩定性可以使酶的作用環境更加廣泛、延長酶反應的時間、降低成本，在工業上具有良好的應用前景。

新瓊二糖水解酶AgWH117A是參與瓊脂代謝的關鍵酶，保證了微生物對新瓊二糖的降解利用，其能夠降解新瓊寡糖生成內醚半乳糖和奇數瓊寡糖的性質也具有極大的工業價值。但在使用過程中發現，對該酶進行固定化時存在熱穩定性差的問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種熱穩定性提高的新瓊二糖水解酶，該新瓊二糖水解酶相比于未改造的蛋白酶具有更好的熱穩定性。

本發明所提供的熱穩定性提高的新瓊二糖水解酶，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的蛋白酶的第134位由K變為D；

所述的氨基酸序列為SEQ ID NO:1的蛋白酶，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ IDNO:2；

本發明所提供的熱穩定性提高的新瓊二糖水解酶,其氨基酸序列為SEQ ID NO:3；

編碼本發明新瓊二糖水解酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:4。

本發明還提供一種重組表達載體，用于表達氨基酸序列為SEQ ID NO:3的新瓊二糖水解酶。

本發明的氨基酸序列為SEQ ID NO:3的新瓊二糖水解酶用于降解新瓊2糖來制備3,6-內醚-L-半乳糖(L-AHG)。

本發明所提供的熱穩定性提高的新瓊二糖水解酶，相比較原始酶而言，該突變子的最適溫度提高了3℃，半衰溫度提高了2.5℃，半衰期t1/2也有了顯著提高，其熱穩定性顯著增強，在40℃保溫40min仍然能夠水解底物新瓊二糖，且該突變子的酶活較原始酶提高了約15％。

附圖說明

圖1：各待篩選突變體位點的熱穩定性結果圖；

圖2：K134D和原始酶的熱穩定性曲線圖；

圖3：K134D和原始酶不同溫度下酶失活實驗結果圖；

圖4：AgWH117原始酶A和突變體K134D最適溫度曲線圖；

圖5：AgWH117原始酶A和突變體K134D最適pH曲線圖。

具體實施方式

新瓊二糖水解酶AgWH117A(氨基酸序列為SEQ ID NO:1，一種編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:2)是參與瓊脂代謝的關鍵酶，保證了微生物對新瓊二糖的降解利用，其能夠降解新瓊寡糖生成內醚半乳糖和奇數瓊寡糖的性質也具有極大的工業價值。本發明對AgWH117A進行了定點飽和突變，篩選獲得了熱穩定性顯著提高的酶。