[發(fā)明專利]一種人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810571592.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-06
• 公開（公告）號(hào): CN108676918A
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚魯帥;白靜;辛君偉;王莎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無錫正則精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 連云港聯(lián)創(chuàng)專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32330
• 代理人: 劉剛

本發(fā)明公開了一種人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒，包括引物AF?F1、引物AF?R1、引物BB?F1、引物BB?R1、探針AF?P1、探針BB?P1，擴(kuò)增預(yù)混液、探針引物預(yù)混液、和陰、陽性質(zhì)控。本發(fā)明的試劑盒，可采用多個(gè)不同的熒光對(duì)多個(gè)不同的探針進(jìn)行標(biāo)記，能夠同時(shí)對(duì)HPV6和HPV11型進(jìn)行檢測(cè)；能夠用于宮頸脫落細(xì)胞的HPV檢測(cè)；經(jīng)過核酸提取和純化后的檢測(cè)過程不超過2小時(shí)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種嗜上皮性病毒，在人和動(dòng)物中分布廣泛，有高度的特異性，HPV的宿主為人類。HPV是一組病毒的總稱，組成一個(gè)科，其病毒形態(tài)類似，DNA限制性內(nèi)切酶圖譜各異，核殼體蛋白質(zhì)的抗原性不同，通過對(duì)人乳頭瘤病毒克隆基因的DNA雜交試驗(yàn)及酶譜分析，至今已鑒定出100多種類型人乳頭瘤病毒，每一型別都與體內(nèi)特定感染部位和病變有關(guān)。所有HPV病毒的基因組結(jié)構(gòu)相似，迄今已發(fā)現(xiàn)多種HPV類型，隨著研究的深入，將會(huì)鑒定出更多HPV新的類型。人乳頭瘤病毒(大約35種型別)可通過多種感染途徑感染婦女生殖道，從而導(dǎo)致尖銳濕疣，約20種與腫瘤相關(guān)。至少有10個(gè)類型與尖銳濕疣有關(guān)(如6，11，16，18及33型，最常見6、11型)，而第11，16，18型，則是國外目前研究宮頸癌、外陰癌甚至陰莖癌的最熱門的病毒因子，其長期感染與女性宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。依據(jù)不同型別HPV與腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性高低分為低危險(xiǎn)型別和高危險(xiǎn)型別HPV，低危險(xiǎn)型別HPV包括HPV6、11、42、43、44等型別，常引起外生殖器濕疣等良性病變包括宮頸上皮內(nèi)低度病變(CIN I)，高危險(xiǎn)型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型別，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變(CIN II/III)的發(fā)生相關(guān)，尤其是HPV16和18型。從高危亞型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染到一般的宮頸癌前病變并最終發(fā)展為宮頸癌大約需要5-10年。因此，有針對(duì)地進(jìn)行HR-HPV的檢測(cè)對(duì)宮頸癌的早期診斷具有重要意義。

目前，HPV分型方法有很多，常見的有細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)技術(shù)方法，如雜交捕獲實(shí)驗(yàn)(HC)、原位雜交技術(shù)(ISH)和PCR方法等。其中，PCR方法較為成熟，具有快速、簡便、靈敏等特點(diǎn)。由于單重PCR通量不高的局限性，一般在進(jìn)行PCR反應(yīng)后還需要做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)才能鑒別HPV不同的亞型；而且，如樣本中存在不同的的型HPV的混合感染，不同的HPV型有不同的擴(kuò)增反應(yīng)效率，導(dǎo)致某些型相對(duì)于其它型有不均衡的擴(kuò)增，不均衡的擴(kuò)增使反應(yīng)平衡趨向于樣品中的高拷貝型，消耗了PCR反應(yīng)的組分，使拷貝數(shù)少的型不易被檢測(cè)出。因此，本試劑盒主要在熒光定量PCR的平臺(tái)上結(jié)合了一種多重?zé)晒釶CR技術(shù)，特異性的FAM標(biāo)記的TaqMan探針對(duì)待檢測(cè)樣本進(jìn)行HPV 6和11亞型的檢測(cè)。PCR多重反應(yīng)是指在同一個(gè)反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或更多基因序列的擴(kuò)增和特異性檢測(cè)。其中，最常見的類型是兩重反應(yīng)。與單重PCR技術(shù)相比，多重PCR技術(shù)具有更高的通量、更低的樣本用量和試劑用量以及檢測(cè)更加快捷等明顯的優(yōu)點(diǎn)。

另外，熒光PCR技術(shù)的熒光探針現(xiàn)已發(fā)展成多種類型，如TaqMan MGB探針、Beacon探針等。Taq-Man探針根據(jù)其3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqMan MGB探針。其中，TaqMan MGB探針的原理一是在探針的3’端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子MGB修飾基團(tuán)，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光標(biāo)記，可大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度，同時(shí)MGB基團(tuán)可以將探針的Tm值提高10℃左右，因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)的更短，既降低了合成成本，大大增加了探針的穩(wěn)定性，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)容易設(shè)計(jì)；(2)探針短；(3)提高配對(duì)與非配對(duì)模板間的Tm值差異；(4)高特異性和高準(zhǔn)確性；(5)穩(wěn)定性好；(6)結(jié)果重復(fù)性好等。但是目前熒光PCR技術(shù)在人類乳頭瘤病毒的檢測(cè)上還不夠成熟，不能夠?qū)崿F(xiàn)高通量的測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種高通量的一種人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒。