[發(fā)明專利]一種豬流行性腹瀉病毒低含量樣品的病毒分離方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810570334.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-05
• 公開（公告）號(hào): CN108486069B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊順利;尹雙輝;蔡建平;李麗;尚佑軍;劉湘濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N7/02;C12N15/11;C07K16/10;H01F1/00;H01F41/00
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發(fā)明公開了一種豬流行性腹瀉病毒(PEDV)低含量樣品的病毒分離方法，還公開了用于豬流行性腹瀉病毒富集和分離的免疫納米磁珠，該免疫納米磁珠具有磁性的Fe₂O₃核心和偶聯(lián)有PEDV膜蛋白特異性單域抗體的表面。傳統(tǒng)方法從多重感染和低PEDV含量樣品中分離病毒，需要病毒純化和長時(shí)間盲傳，分離效率低，限制了PEDV的研究工作。本發(fā)明利用納米磁珠和PEDV特異性單域抗體制備了免疫納米磁珠，能夠有效捕獲和富集糞便、組織等多種樣品中的PEDV。樣品經(jīng)處理后利用免疫納米磁珠進(jìn)行病毒捕獲和富集，將結(jié)合病毒的免疫納米磁珠直接接種到Vero細(xì)胞，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒分離。本發(fā)明制備的免疫納米磁珠和PEDV分離方法，適用于臨床復(fù)雜和低病毒含量樣品中PEDV的快速、有效分離。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于豬流行性腹瀉病毒(PEDV)分離的免疫納米磁珠，還涉及PEDV低含量臨床樣品的病毒高效分離方法。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬流行性腹瀉病毒(poreine epidemic diarrhea virus，PEDV)屬于尼多病毒目(Nidovirales)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，是引起豬流行性腹瀉(PED)的病原。PED是以感染豬的腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病，各種年齡的豬都能感染發(fā)病，尤其對(duì)哺乳仔豬具有較高致死率。豬流行性腹瀉發(fā)病區(qū)域遍及全球，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大危害。對(duì)臨床上患PED豬樣品中病毒的快速分離鑒定，是研究PEDV流行病學(xué)、分子生物學(xué)以及高效疫苗研制的必要環(huán)節(jié)。然而，目前臨床病原感染復(fù)雜多樣，已經(jīng)罕見單一病原感染的臨床病例，這種情況使用常規(guī)方法對(duì)單一病原分離十分困難。同時(shí)對(duì)于一些低病原含量樣本，使用常規(guī)方法分離也很難獲得成功。因此，建立對(duì)臨床多重感染和低病原含量樣品中的目標(biāo)病原有效分離的方法，對(duì)病原學(xué)、流行病學(xué)和疫苗等研究具有重要意義。

免疫磁珠在生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用日漸普遍，尤其在病原檢測和分離等方面。免疫磁珠分離技術(shù)是以抗體包被的磁珠為載體，利用抗原、抗體的特異性結(jié)合形成抗原-抗體-磁珠復(fù)合物，該復(fù)合物在磁場作用下可定向運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)抗原的特異性地分離。該方法結(jié)合了分散固相萃取的高效性、免疫親合作用的特異性及磁回收的簡便性，可有效簡化前處理流程，縮短前處理時(shí)間，提高富集和分離效率。隨著納米磁珠制備和表面包被技術(shù)的不斷成熟完善，各種抗體以及特異性親和因子等都可用于磁珠包被，從而獲得免疫磁珠，這些免疫磁珠的特異性則完全取決于包被的抗體或親和因子。目前，常用的主要抗體包括單克隆抗體(IgG)、單鏈抗體、單域抗體(sdAb)等。單域抗體是駱駝科和軟骨鯊魚等血清天然存在的僅有重鏈的IgG抗體，該類抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈可變區(qū)的單一結(jié)構(gòu)域組成，又稱為重鏈抗體(VHH)或納米抗體(Nanobody，Nb)。sdAb同普通IgG抗體分子一樣保持了良好的、特異的抗原結(jié)合能力。同時(shí)，sdAb還具有易于在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中可溶性表達(dá)、耐高溫、耐極度pH值等獨(dú)特性質(zhì)。這些特性使sdAb成為免疫磁珠制備的理想候選抗體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的是提供一種能夠結(jié)合并高效富集豬流行性腹瀉病毒(poreineepidemic diarrhea virus，PEDV)的免疫納米磁珠；本發(fā)明的另一目的是提供一種PEDV低含量樣品病毒有效分離的方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明的一種能夠捕獲并富集豬流行性腹瀉病毒(poreine epidemic diarrheavirus，PEDV)的免疫納米磁珠，該免疫納米磁珠具有磁性的Fe₂O₃核心和偶聯(lián)有PEDV膜蛋白特異性單域抗體的表面，該P(yáng)EDV膜蛋白特異性單域抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種制備所述的免疫納米磁珠的方法，包括以下步驟：

(1)納米磁珠的活化