[發明專利]一種微藻細胞中的脂肪酸不飽和度的測定方法

在審

• 申請號: 201810563785.1
• 申請日: 2018-06-04
• 公開（公告）號: CN108663350A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 邵詠妮;朱亦鳴;莊松林;顧偉民
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 吳寶根

1.一種微藻細胞中的脂肪酸不飽和度的測定方法，其特征在于具體包括以下步驟：

(1)、采用雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀測定β-胡蘿卜素標準品的拉曼光譜曲線，計算β-胡蘿卜素標準品在1445cm^-1和1525cm^-1的拉曼峰強的比值為A；

(2)、經瓊脂固定的待測微藻細胞樣品的制備

①、將待測微藻接種到裝有微藻培養基的250ml錐形瓶中，然后置于簡易光生物培養機上，控制溫度25℃、相對濕度為80％、光照強度2500Lux-3500Lux進行光照培養一周，光照培養過程中每24h中光照12h、黑暗12h，得到微藻液；

所述的待測微藻為蛋白核小球藻、微綠球藻、普通小球藻、衣藻或雨生紅球藻；

取穩定期的微藻液作為待測微藻液；

取上述的待測微藻液8ml于15ml離心管中，然后加入2ml蒸餾水稀釋藻液，得到稀釋后的待測微藻液；

②、用質量百分比濃度為2-4％的瓊脂水溶液固定步驟①所得的稀釋后的待測微藻液中的待測微藻細胞，得到經瓊脂固定的待測微藻細胞樣品；

(3)、通過雙層刀片切取步驟(2)所得的經瓊脂固定的待測微藻細胞樣品，放置于載玻片上，蓋上蓋玻片，然后放置在雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀的載物臺上，控制溫度為25℃，利用激光強度為1mv的激光束，并通過50X的物鏡聚焦到經瓊脂固定的待測微藻細胞樣品的表面，曝光時間1s，在雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀下進行觀察將瓊脂固定的待測微藻細胞樣品，得到待測微藻細胞樣品拉曼光譜原始信息，然后將所得到的待測微藻細胞樣品拉曼光譜原始信息依次進行預處理、去除宇宙射線、基線校正和去噪平滑處理，最終得到待測微藻細胞的拉曼光譜曲線，進一步得到待測微藻細胞在1525cm^-1處的拉曼峰強為F1，在1445cm^-1的拉曼峰強為F2，在1660cm^-1的拉曼峰強為F5；

所述的預處理是采用去趨勢算法De-trending對拉曼光譜原始信息進行處理；

所述的去除宇宙射線是采用Renishaw的Wire3.3軟件對拉曼光譜原始信息進行處理；

所述的基線校正是采用Unscrambler軟件對拉曼光譜原始信息進行處理；

所述的去噪平滑處理是采用卷積平滑方法對拉曼光譜原始信息進行處理；

(4)、利用β-胡蘿卜素標準品在1445cm^-1和1525cm^-1的拉曼峰強的比值A和待測微藻細胞拉曼光譜曲線在1525cm^-1處的拉曼峰強F1，計算出待測微藻細胞在1445cm^-1處其含有β-胡蘿卜素的拉曼峰強F3，即F3＝A*F1；

(5)、將待測微藻細胞在1445cm^-1的拉曼峰強F2扣除其在1445cm^-1處其含有β-胡蘿卜素的拉曼峰強F3，即得到待測微藻細胞不含β-胡蘿卜素，僅為有效的脂肪酸在1445cm^-1的拉曼峰強F4，即F4＝F2-F3；

(6)、通過脂肪酸標準品不飽和度和1660cm^-1和1445cm^-1下的拉曼峰強的比值的關系，得到脂肪酸標準品不飽和度的計算公式：IV＝-8.0436x²+116.59x+9.469，其中IV為脂肪酸標準品的不飽和度，x為脂肪酸標準品在1660cm^-1和1445cm^-1下的拉曼峰強的比值；

(7)、將待測微藻細胞在1660cm^-1和1445cm^-1下的拉曼峰強的比值F5/F4作為x代入步驟(6)所得的公式IV＝-8.0436x²+116.59x+9.469中，即得待測微藻細胞中的脂肪酸不飽和度值IV。