[發明專利]一種用于藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的方法

在審

• 申請號: 201810562206.1
• 申請日: 2018-06-04
• 公開（公告）號: CN108823292A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 謝冬梅;金傳山;彭代銀;俞年軍;劉叢彬;朱月健;吳計劃;孫小草
• 申請（專利權）人: 安徽中醫藥大學;安徽普康中藥資源有限公司;北京同仁堂安徽中藥材有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6895
• 代理公司: 廈門智慧呈睿知識產權代理事務所(普通合伙) 35222
• 代理人: 楊玉芳

本發明公開了一種用于藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的方法，本發明結構科學合理，使用安全方便，本發明采用Illumina HiSeq4000高通量測序平臺對5年生藥用牡丹“鳳丹”根皮轉錄組進行測序的數據中，對檢測到SSR序列進行篩選和引物設計，通過多態性篩選，設計合成M13加尾引物在不同來源藥用牡丹和油用牡丹種質樣本中進行多態性驗證，并對獲得的具有多態性產物再次測序，分析其序列長度，開發出一對微衛星分子標記引物，可以較好地應用于鑒別藥用牡丹和油用牡丹種質，為藥用牡丹和油用牡丹種質來源區分提供了有效可靠的鑒定手段，為解決中藥牡丹皮的種質來源鑒定提供了一種新的手段，有著良好的推廣價值。

技術領域

本發明屬于藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定技術領域，具體涉及一種用于藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的方法。

背景技術

微衛星DNA是指基因組中由短的重復單元(一般為1～6個堿基)組成的DNA串聯重復序列，又被稱作簡單重復序列(Simple Sequence Repeat,SSRs)，廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，而且分布比較均勻，平均每10kb的DNA序列中就會出現一個微衛星序列，再加上SSR的重復次數不同和重復程度不同，使其呈現高度的多態性，由于SSR的兩端有一段保守的DNA序列，根據這段序列可以設計一段互補序列的寡聚核苷酸引物，對SSR進行PCR擴增。

中藥牡丹皮(Moutan Cortex)來源于毛茛科植物牡丹(Paeonia suffruticosaAndr.)的干燥根皮，具有清熱涼血，活血化瘀的功效。

然而現有的藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的過程中仍然存在著一些不合理的因素，現有的藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的不是很準確合理，存在很大的誤差，如何為藥用牡丹和油用牡丹種質來源區分提供了有效可靠的鑒定手段，以及解決中藥牡丹皮的種質來源鑒定方案越來越被重視，為此本發明提供一種用于藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的方法，以解決上述背景技術中提出的現有的藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的過程中仍然存在著一些不合理的因素，現有的藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的不是很準確合理，存在很大的誤差問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種用于藥用牡丹和油用牡丹種質鑒定的方法，所述鑒定方法如下：

步驟一：選取藥用牡丹和油用牡丹作為驗證樣本；

步驟二：選擇儀器與試藥，NAS-99分光光度計、BC-subMIDI電泳槽、BG-Power300C電泳電源、1-14離心機、Verity PCR儀、凝膠成像儀、DHP-9052恒溫培養箱、搖床、3730xl基因分析儀、HiSeq2500，內切酶HaeIII(NEB R0108M)、Hi-Di去離子甲酰胺、POP-7膠、10×Buffer(4311320)、Platinum taq酶(Thermo，10966026)；

步驟三：引物設計與多態性引物篩選，采用改良CTAB法提取樣品DNA，凝膠電泳檢測質量，對合成的44對不同引物進行擴增，

步驟四：將步驟三所述的44對不同引物進行擴增，TP-M13-SSR擴增反應體系為10μL，降落擴增程序；

步驟五：將步驟四所述的不同引物進行擴增，降落擴增程序后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，挑選有目的條帶的產物上3730xl基因分析儀檢測后進行數據分析；

步驟六：通過不同來源的隨機兩份驗證樣本進行再次擴增后進行測序，篩選后獲得6對具有多態性引物；

步驟七：將步驟六所述篩選后獲得5對多態性引物TP-M13-SSR所檢測的不同藥用牡丹和油用牡丹栽培種質在不同SSR位點的多態性原始數據；