[發明專利]一種嗜水氣單胞菌疫苗候選外膜蛋白的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201810559647.6
• 申請日: 2018-06-02
• 公開（公告）號: CN108753798B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 林向民;郭壯;林文雄;李薇;汪玉倩
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/195;A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供一種嗜水氣單胞菌疫苗候選外膜蛋白的制備方法及應用，設計外膜蛋白基因克隆引物；通過原核重組，利用體外PCR擴增技術，擴增目的基因片段，構建pET32a原核表達載體重組質粒，轉化重組質粒至BL21感受態，獲得高表達菌株；通過IPTG誘導劑誘導高表達OMP P5蛋白并通過Ni?NTA樹脂柱純化該表達蛋白；純化后的外膜蛋白與弗氏不完全佐劑以1:1體積比完全乳化，所得樣品即作為嗜水氣單胞菌疫苗的疫苗蛋白。本發明中采用嗜水氣單胞菌亞單位疫苗（外膜蛋白）可獲得90%以上免疫保護率，相比于傳統疫苗，亞單位疫苗具有毒副作用低、免疫原性強和持續時間長、抗體效價高等優點。

技術領域

本發明涉及基因工程與免疫學領域，具體涉及一種嗜水氣單胞菌疫苗候選外膜蛋白的制備及應用。

背景技術

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)屬革蘭氏陰性短桿菌，廣泛存在于水生環境中的一種常見條件致病菌，是典型的人-畜-魚共患病病原菌，其典型病狀為使魚類出血性敗血癥而受到水產學界、獸醫學界和醫學界的廣泛重視，成為公共衛生關注的對象。作為養殖大國，嗜水氣單胞菌嚴重損害著我國養殖業的發展，甚至威脅到人類安全。目前，針對嗜水氣單胞菌等水產致病菌的治療藥物主要是抗生素，然而長期大量使用抗生素易產生耐藥株，甚至是超強細菌，急切需要有效的疫苗進行替代。預防和解決由該菌引起的疾病的關鍵在于研制并發現有效的候選疫苗。

嗜水氣單胞菌主要致病因子可以分為粘附因子、胞外產物、轉鐵蛋白以及各類分泌系統。目前針對其致病因子研發的疫苗主要有傳統疫苗、 核酸疫苗和亞單位疫苗等，傳統的疫苗通過失活或減毒嗜水氣單胞菌強毒株為抗原免疫，并獲得50%左右的免疫保護率（李圓圓等 2008；陳亨利等 2016）。諸如外膜蛋白、外毒素和菌毛等亞單位疫苗因接種劑量小、毒副作用小、免疫原性強和持續時間長等優點而廣泛應用。外膜蛋白(outer membraneprotein, OMP)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結構，在細菌代謝物質的運輸、維持細菌的形態及調節細菌有關物質合成方面起著重要作用。細菌外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可激發機體的體液免疫，而且還可誘導細胞介導的免疫應答等優點備受青睞。細菌外膜蛋白具有良好的免疫原性,不僅可激發機體的體液免疫,而且還可誘導細胞介導的免疫應答等優點備受青睞。目前研究者（孫黎等 2013； 鄭宗林等 2015）對外膜蛋白疫苗研究中發現60-80%免疫保護率，然而達不到90%以上。

發明內容

本發明的目的在于提供一種嗜水氣單胞菌疫苗候選外膜蛋白的制備方法及應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

利用基因工程技術，根據嗜水氣單胞菌ATCC7966全基因組序列，設計外膜蛋白（Outer membrane protein P5）基因克隆引物AHA_3793-EcoRI-F:CGGGAATTCATGAATAAAACACTGATTACCTTGC；AHA_3793-HindIII-R:CCCAAGCTTTCACTGCTGAACTTCCGAGATCCCT。

通過原核重組，利用體外PCR擴增技術，擴增目的基因片段，構建pET32a原核表達載體重組質粒，（基因與pET32a質粒摩爾比為5:1）轉化重組質粒至BL21感受態，獲得高表達菌株。通過IPTG誘導劑誘導高表達OMP P5蛋白并通過Ni-NTA樹脂柱純化該表達蛋白。純化后的外膜蛋白與弗氏不完全佐劑1:1體積比完全乳化所得樣品即可作為嗜水氣單胞菌疫苗的疫苗蛋白。

本發明所要解決的問題是通過與佐劑乳化完全后的外膜蛋白疫苗免疫模式生物斑馬魚對嗜水氣單胞菌可獲得90%以上免疫保護率。

本發明的優點在于：