[發明專利]一種烏頭花葉病病原物分子鑒定方法及防治應用

在審

• 申請號: 201810558524.0
• 申請日: 2018-06-01
• 公開（公告）號: CN108504781A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 侯大斌;余馬;張洪;舒曉燕;唐志康;黃晶;何靜;李玉嬋
• 申請（專利權）人: 西南科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種烏頭花葉病病原物分子鑒定方法，其特征在于，包括以下操作：

1)采集表現出烏頭花葉病癥狀的病樣，截取病樣的須根進行總RNA提取并去除基因組DNA；然后對所提取的總RNA進行逆轉錄，獲取基因組cDNA；

2)以獲取的基因組cDNA為模板，以CMV cp-F、CMV cp-R為引物進行RT-PCR擴增，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

所述的CMVcp-F：5’-ATGGACAAATCTGAATCAACCA-3’；

所述的CMVcp-R：5’-GACTGTCACCCACACGGTAGAAT-3’；

3)若電泳檢測結果中出現376bp長度的條帶，則初步表明該病樣的病原物為CMV亞組II成員中的CMV-FZ。

2.如權利要求1所述的烏頭花葉病病原物分子鑒定方法，其特征在于，獲得瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物之后，對376bp的目的片段進行回收測序，若測序結果與SEQ.ID.NO.1所示的序列相一致，則確定該病樣的病原物為CMV-FZ。

3.如權利要求1所述的烏頭花葉病病原物分子鑒定方法，其特征在于，所述的總RNA提取是采用RNA prepPure提取試劑盒進行提取，采用DNaseI去除基因組DNA，運用反轉錄試劑盒進行逆轉錄；

逆轉錄反應程序：25℃變性10min，50℃保溫45min，85℃保溫5min。

4.如權利要求1所述的烏頭花葉病病原物分子鑒定方法，其特征在于，所述的RT-PCR擴增中，RT-PCR擴增體系為：5μL 10×Easy Taq buffer(plus Mg²⁺)，1μL濃度為10mmol·L^-1的dNTP Mixture，0.5μL濃度為10μmol·L^-1的上游引物，0.5μL濃度為10μmol·L^-1的下游引物，1μL濃度為5U·μL^-1的Easy Taq，2μL cDNA模板，ddH2O補充至15μL；

擴增反應條件：95℃預變性5min；94℃變性30s，55.7℃退火30s；72℃延伸1min；35個循環；最后一輪循環后72℃延伸5min。

5.以CMV-FZ作為病原物防治對象在防治烏頭花葉病中的應用。

6.以CMV-FZ作為病原物在制備防治烏頭花葉病的藥物中的應用。