[發明專利]一種A型血友病慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201810549382.1
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108795986A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 郭筱璐
• 申請（專利權）人: 深圳市免疫基因治療研究院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N7/01;A61K48/00;A61K38/37;A61P7/04
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供一種A型血友病慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用，所述慢病毒載體為在pTYF慢病毒載體的5’端的剪接供體位點進行改造，其中，所述慢病毒載體還包括FVIII和/或FVIII?BDD基因。本申請改造后的慢病毒載體的基礎上特異地連入FVIII和/或FVIII?BDD基因，能夠在保障安全性的同時實現更高效的基因傳遞，使得FVIII和/或FVIII?BDD基因在骨髓相關細胞中的表達量明顯增加，能夠更高效的完成A型血友病基因治療過程中正常基因的傳遞。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種A型血友病慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用，尤其涉及一種應用改良后的慢病毒載體優化表達FVIII和/或FVIII-BDD基因用于制備治療A型血友病的藥物。

背景技術

A型血友病(Hemophilia A)是一種由于X染色體連鎖的凝血因子VIII(FVIII)基因突變造成的FVIII蛋白缺失或功能不全而引起的機體凝血功能障礙的出血性疾病。根據血漿中該因子的活性程度將疾病分為三種類型：嚴重(<1％)，中度(1％-5％)，輕度(5％-50％)。該病患者活性凝血活酶生成障礙，凝血時間延長，終身具有輕微創傷后出血傾向，重癥患者即使沒有明顯外傷也可發生“自發性”出血，情況嚴重者可導致死亡。血友病的發病率為15/10萬～20/10萬，其中血友病A占85％且發病沒有地域與種族間的差異

目前主要是依靠補充功能正常的FVIII蛋白來進行替代治療(Replacementtherapy)，主要使用人血中提取或重組純化的FVIII蛋白。然而該蛋白的來源血液制劑存在人免疫缺陷病毒(HIV)及肝炎病毒等病原污染的可能，雖然隨著基因工程方法應用于因子的合成及純化，感染傳染病的風險被大大降低，但是病人持續性的替代治療醫療費用十分高昂，并且需要終生治療，生活質量低下。事實上，只要患者血漿中凝血因子活性少量增加(≥正常水平的2％)就可以顯著改善病癥，這使得基因治療方法成為根治該病的一種可能，為A型血友病患者帶來全新的希望。

在此之前已經有針對FVIII基因治療相關的研究，其中有研究報道應用攜帶編碼正常FVIII蛋白基因的慢病毒載體轉染骨髓細胞，再將該骨髓細胞移植入FVIII敲除小鼠模型體內進行治療。此報告中結果顯示，在體外觀察到了一定量的FVIII表達，但FVIII在體內的表達量小，沒有表現出明顯的治療效果。因此如何更高效的實現FVIII基因在體內的傳遞與表達是實現A型血友病有效基因治療的關鍵。

其后，WO/2017/083764公開了一種應用腺病毒相關病毒(AAV)載體攜帶FVIII-BDD(B domain deleted)基因治療A型血友病的方法，因為FVIII基因中B結構域對其蛋白的正常功能沒有明顯的作用，因此刪去后并不影響該蛋白的促凝血功能，并能夠顯著減小蛋白大小，降低免疫原性。該方法顯示在哺乳動物細胞中能夠較好的提高FVIII蛋白的表達量，因此可能會對臨床A型血友病的臨床效果有較好的提升。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種A型血友病慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用，所述A型血友病慢病毒載體轉染效率更高，穩定性更強，安全性更好。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種慢病毒載體，所述慢病毒載體為在pTYF慢病毒載體的5’端的剪接供體位點進行改造，具體改造方式如下：

(a)其5’端的剪接供體位點被刪除或改造，改造后的慢病毒載體剪接供體位點不是所述包裝載體和所述參照慢病毒之間的同源重組的潛在位點；

(b)其仍具有病毒包裝信號功能；

其中，所述慢病毒載體還包括FVIII和/或FVIII-BDD基因。