[發明專利]使用重組大腸桿菌發酵制備環二核苷酸的方法

有效

• 申請號: 201810545363.1
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108913737B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 朱德裕;呂云;朱敬
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12P19/36
• 分類號: C12P19/36;C07H19/213;C07H1/06;C12R1/19
• 代理公司: 濟南舜昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 37249
• 代理人: 宋玉霞

1.一種使用重組大腸桿菌發酵制備2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，包含以下步驟：

1）構建重組載體，使用目的基因和質粒構建重組載體，所述目的基因為鼠源cGAS酶基因；

2）轉化，將所述重組載體轉化至大腸桿菌感受態細胞中，所述大腸桿菌感受態細胞為BL21-CodonPlus (DE3)-RIL菌株；

3）陽性克隆驗證，驗證并選擇轉化成功的重組大腸桿菌克??；

4）誘導，添加誘導劑，誘導所述轉化成功的重組大腸桿菌發酵產生2’3’-cGAMP；

5）分離純化，所述分離純化包括以下步驟：

a) 取培養上清液，抽濾，酸化，抽濾；

b) 使用大孔吸附樹脂柱對步驟a)所得產物進行層析，獲得第一2’3’-cGAMP粗品；

c) 使用離子交換樹脂柱對所述第一2’3’-cGAMP粗品進行層析，獲得第二2’3’-cGAMP粗品；

d) 使用C18柱對所述第二2’3’-cGAMP粗品進行層析，獲得第三2’3’-cGAMP粗品；

e) 使用葡聚糖凝膠色譜柱對所述第三2’3’-cGAMP粗品進行層析，收集主峰，干燥后獲得純2’3’-cGAMP。

2.根據權利要求1所述的使用重組大腸桿菌發酵制備2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，所述質粒為pet28a質粒，使用限制性酶切位點BamHI和XhoI將鼠源cGAS酶基因構建至所述pet28a質粒中。

3.一種使用重組大腸桿菌發酵制備c-di-GMP的方法，其特征在于，包含以下步驟：

1）構建重組載體，使用目的基因和質粒構建重組載體，所述目的基因為海棲熱袍桿菌Thermotoga maritima的二鳥苷酸環化酶tDGC R158A基因tDGCm和人源干擾素刺激基因STING^CTD；

2）轉化，將所述重組載體轉化至大腸桿菌感受態細胞中，所述大腸桿菌感受態細胞為BL21(DE3)菌株；

3）陽性克隆驗證，驗證并選擇轉化成功的重組大腸桿菌克??；

4）誘導，添加誘導劑，誘導所述轉化成功的重組大腸桿菌發酵產生c-di-GMP；

5）分離純化，所述分離純化包括以下步驟：

a) 取培養物，加入雙蒸水重懸菌體，加熱、混勻并離心；

b) 取上清液，加入冷乙醇，混勻后靜置，離心；

c) 取上清液，加入NaCl和EDTA，混勻后靜置，離心；

d) 棄去上清液，用雙蒸水重懸沉淀，使用氨基丙柱進行層析，獲得第一c-di-GMP粗品；

e) 使用C18柱對所述第一c-di-GMP粗品進行層析，獲得第二c-di-GMP粗品；

f) 使用葡聚糖凝膠色譜柱對所述第二c-di-GMP粗品進行層析，收集主峰，干燥后獲得純c-di-GMP。

4.根據權利要求3所述的使用重組大腸桿菌發酵制備c-di-GMP的方法，其特征在于，所述質粒為經改造pet15b和pet30a質粒，所述pet15b的N端的凝血蛋白酶位點被PPase蛋白酶位點取代，使用限制性酶切位點BamHI和XhoI將所述tDGCm基因構建至所述pet15b質粒中，且使用限制性酶切位點NdeI和XhoI將所述STING^CTD基因構建至所述pet30a質粒中。