[發(fā)明專利]檢測血液中氯硝西泮含量的在線固相萃取液相色譜分析方法

有效

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• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108445113B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙金寶;許麗;賈永娟;倪君君
• 申請（專利權(quán)）人: 北京和合醫(yī)學診斷技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京坦路來專利代理有限公司 11652
• 代理人: 汪送來

本發(fā)明檢測血液中氯硝西泮含量的在線固相萃取液相色譜分析方法是使用高效液相色譜儀和DVD檢測器對標準溶液進行標定，擬合得到標準曲線方程為y＝a*x+b，取待測血液樣品，在該待檢測血液經(jīng)過處理后，同樣使用高效液相色譜儀和DVD檢測器對待測的樣品進行檢測，得到待測血液y值，將待測血液y代入標準曲線方程中，通過計算得到待測血液樣品中氯硝西泮相對濃度x，內(nèi)標物工作液濃度是已知的，由此計算得到該樣本中待檢測血液中的氯硝西泮藥物濃度，本發(fā)明血清經(jīng)沉淀離心后直接進樣，使檢測過程簡便快速，實驗成本降低，更利于在臨床治療中對患者體內(nèi)的氯硝西泮血藥濃度進行監(jiān)測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及精神類藥物的臨床血藥濃度監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測血液中抗癲癇抗驚厥藥物氯硝西泮濃度的方法。

背景技術(shù)

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有突然、反復發(fā)作的特點，目前臨床上首選藥物治療。氯硝西泮是廣譜的抗癲癇藥物，用于控制各型癲癇發(fā)作，對失神發(fā)作、嬰兒痙攣癥、肌陣攣性及運動不能性發(fā)作療效較好。也可用于藥物引起的注意缺陷障礙(多動癥)和各種神經(jīng)痛的治療。其口服后通過胃腸道后，在血液中循環(huán)的活性化合物為氯硝西泮。氯硝西泮(Clonazepam，CZP)，分子式為C₁₅H₁₀ClN₃O₃，具體化學結(jié)構(gòu)如下圖1所示。氯硝西泮的有效血藥濃度參考區(qū)間：20.00～70.00ng/mL(抗驚厥)4.00～80.00ng/mL(抗焦慮催眠)，當血藥濃度＞100ng/mL時，毒副作用增強。常見不良反應(yīng)有動作不靈活、步態(tài)不穩(wěn)、嗜睡，共濟失調(diào)及行為紊亂如激動、興奮、不安、出現(xiàn)攻擊行為等；少見的有視力模糊、便秘、腹瀉、眩暈或頭昏、頭痛、氣管分泌物增多或流涎、惡心、嘔吐、排尿障礙、語言不清、口干。氯硝西泮主要通過神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮其藥理作用，由于其治療窗較窄，體內(nèi)代謝過程存在較大的個體差異，服藥周期長，給藥劑量和血藥濃度相關(guān)性不穩(wěn)定，而血藥濃度與療效及毒性反應(yīng)相關(guān)，用藥劑量不足與藥物過量的臨床癥狀相似，所以對其血藥濃度的監(jiān)測是調(diào)整劑量，減少不良反應(yīng)的重要參考，在臨床用藥中具有重大意義。

目前常用的氯硝西泮血藥濃度的測定方法眾多，各有優(yōu)缺點，包括高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。氣相色譜法檢測時對樣本先進行衍生化處理，此前處理過程較為繁瑣。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血藥濃度具有靈敏度高、專屬性強等優(yōu)點，成本較高，且對人員和環(huán)境的要求較高。高效液相色譜法定量準確，重現(xiàn)性好，且經(jīng)濟效益好，但目前仍存在前處理復雜，分析時間較長等問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明目的是提供一種檢測血液中氯硝西泮藥物濃度的方法，使氯硝西泮血藥濃度的測定快速準確，很大程度上縮短樣本分析時間。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的一種檢測血液中氯硝西泮含量的在線固相萃取液相色譜分析方法，其中：它包括以下步驟：

(一)標準溶液的標定

首先用移液槍將至少三種不同濃度的標準工作液10μL、10μL標準內(nèi)標液和190μL空白血清分別置于1.5ml離心管中混合制成至少三種標準溶液，上述標準溶液分別在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm下渦旋混勻30s-1min后，加入含有0.2mol/L硫酸鋅甲醇溶液的沉淀劑200μL，并在轉(zhuǎn)速為1200-2000rpm下渦旋混勻2-4min后，再在轉(zhuǎn)速10000-15000rpm下高速離心4-6min后，得到上清液，分別取上述上清液200uL，用高效液相色譜儀和DVD檢測器對上述上清液進行檢測，分別得出上述至少三種標準溶液中的氯硝西泮色譜圖和2-萘酚色譜圖，以上述至少三個標準溶液的氯硝西泮峰面積與2-萘酚峰面積之比作為標準曲線圖的縱坐標y，以上述標準工作液中含有氯硝西泮的濃度與標準內(nèi)標液中含有2-萘酚濃度之比作為標準曲線圖的橫坐標x，將以上檢測所得至少三組數(shù)據(jù)進行線性回歸，擬合得到標準曲線方程為y＝a*x+b，并且得出權(quán)重系數(shù)a和b，標準工作液是含有氯硝西泮的溶液，標準內(nèi)標液是含有2-萘酚的溶液；

(a)標準工作液的配制：