[發明專利]一株I型牛皰疹病毒gE缺失毒株及其獲取方法

有效

• 申請號: 201810542104.3
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108690835B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 溫永俊;楊洋;何芳;溫永勝;月英
• 申請（專利權）人: 內蒙古元山生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/85
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

1.I型牛皰疹病毒gE缺失毒株的獲取方法，包括以下步驟：

1）以I型牛皰疹病毒基因組為模板，分別利用gE基因上游同源臂引物對和下游同源臂引物對擴增，分別得到gE基因上游同源臂和gE基因下游同源臂；

所述gE基因上游同源臂引物對的上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.1所示，所述gE基因上游同源臂引物對的上游引物5’端加入酶切位點HindIII后再進行擴增；所述gE基因上游同源臂引物對的下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.2所示，所述gE基因上游同源臂引物對的下游引物5’端加入酶切位點KpnI后再進行擴增；

所述gE基因下游同源臂引物對的上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.3所示，所述gE基因下游同源臂引物對的上游引物5’端加入酶切位點BamHI后再進行擴增；所述gE基因下游同源臂引物對的下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.4所示，所述gE基因下游同源臂引物對的下游引物5’端加入酶切位點EcoRI后再進行擴增；

2）將所述步驟1）得到的gE基因上游同源臂采用HindIII和KpnI進行雙酶切，得到gE基因上游同源臂酶切產物；將所述步驟1）得到的gE基因下游同源臂采用BamHI和EcoRI進行雙酶切，得到gE基因下游同源臂酶切產物；

3）將所述步驟2）得到的gE基因上游同源臂酶切產物與PCDNA3.1（+）進行連接，得到gE基因上游同源臂連接產物；所述PCDNA3.1（+）質粒是用HindIII和KpnI進行酶切處理后得到；

4）將所述步驟3）得到的gE基因上游同源臂連接產物進行轉化、提取質粒，得到質粒pBHV-3；

5）將所述步驟4）得到的質粒pBHV-3采用BamHI和EcoRI進行雙酶切，得到質粒pBHV-3酶切產物，將所述質粒pBHV-3酶切產物與步驟2）得到的gE基因下游同源臂酶切產物進行連接，得到gE基因下游同源臂連接產物；

6）將所述步驟5）得到的gE基因下游同源臂連接產物進行轉化、提取質粒，得到重組質粒pBHV-1；

7）在sgRNA-1上游引物和sgRNA-1下游引物的5’端分別加入酶切位點BbsI后進行變性退火延伸，得到sgRNA-1；所述sgRNA-1上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.5所示，所述sgRNA-1下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.7所示；

在sgRNA-2上游引物和sgRNA-2下游引物的5’端分別加入酶切位點BbsI后進行變性退火延伸，得到sgRNA-2；所述sgRNA-2上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.6所示，所述sgRNA-2下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.8所示；

8）將pSpCas9-2A-Puro經BbsI酶切后，得到pSpCas9-2A-Puro酶切產物，將所述pSpCas9-2A-Puro酶切產物分別與步驟7）所述的sgRNA-1和sgRNA-2連接，得到含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro；

9）將步驟8）得到的含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro分別經轉化、提取質粒后，得到切割質粒pSpCas9-2A-Puro-1和切割質粒pSpCas9-2A-Puro-2；

10）將所述步驟6）得到的重組質粒pBHV-1與步驟9）得到的切割質粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割質粒pSpCas9-2A-Puro-2混合后轉染vero細胞，轉染5~7h后以MOI為0.1感染I型牛皰疹病毒，1.5~2.5d后得到空白斑，將所述空白斑接種于DMEM液體培養基后進行凍融，將得到的凍融物接種于單層MDBK細胞上進行感染，4h后將得到的感染物接種于含有胎牛血清的培養基中，出現病變后挑取噬斑，得到I型牛皰疹病毒gE缺失毒株；所述重組質粒pBHV-1與切割質粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割質粒pSpCas9-2A-Puro-2的質量比為4:1:1；

步驟7）中所述sgRNA是在gE基因起始密碼子的250bp處設計而得到的。