[發明專利]表皮干細胞中采用CRISPR-Cas系統進行CNE10基因敲除

有效

• 申請號: 201810542016.3
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108707604B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 韓之波;楊駿;朱成光
• 申請（專利權）人: 江西漢氏聯合干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N9/22
• 代理公司: 佛山卓就專利代理事務所(普通合伙) 44490
• 代理人: 陳雪梅

本發明提供了一種采用CRISPR?cas系統針對表皮干細胞進行CNE10基因編輯，特別是涉及一種構建CNE10基因敲除的表皮干細胞細胞系的建立。其中構建并獲得了兩個特異的gRNA，能夠顯著提高表皮干細胞內CRISPR/Cas9針對CNE10的基因編輯效率。本發明提供的表皮干細胞CNE10敲除質粒具有較好的遺傳穩定性以及較高的打靶效率。

技術領域

本發明提供一種采用CRISPR-cas系統針對表皮干細胞進行CNE10基因編輯，特別是涉及一種構建CNE10基因敲除的表皮干細胞細胞系的建立。

背景技術

表皮干細胞(Epidermal stem cells，EpiSCS)是具有自我增殖和多向分化潛能的干細胞，它的正常增殖和分化是維持皮膚及其附屬器(汗腺毛發、皮脂腺)結構和功能完整性的基本要求。在生理條件下，表皮干細胞通過不對稱分裂方式分化為一個干細胞和一個短暫擴充細胞(transit amplifying cellsTA細胞)，TA細胞再經過多次分裂后分化為有絲分裂后細胞(Post-mitotic cells)及終末分化細胞(terminally-differentiatedcells)，以補充表皮細胞不斷更新的需要。研究表明表皮干細胞不僅能在體外長期傳代培養，并保持其增殖分化潛能(Dunnwald et al，Exp Dermatol，2001，10：45-54.Papini etal.stem cells，2003，21：481-494)，而且，在一定環境條件下還表現出與胚胎干細胞相似的分化潛能[Liang et al，stem cells，2002：20：21-31]。因此，獲得純化的表皮干細胞不僅可為構建有生理功能的人工皮膚提供種子細胞，而且可用于基因治療和轉基因動物的生產。

人類多能干細胞(Human pluripotent stem cells,hPSCs)和基因組編輯技術結合所建立的細胞模型，為疾病研究提供了一個獨特的實驗平臺。利用這個平臺體系，研究人員可以研究特定基因突變甚至染色體結構變異對人類多種細胞類型和組織器官功能的影響及其詳細的分子機制，并可建立攜帶不同遺傳突變的“個性化”疾病模型用于大規模藥物篩選。該模型體系的建立得益于基因組編輯技術，尤其是CRISPR/Cas9(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins9,CRISPR/Cas9)技術的飛速發展。

保守非編碼元件(Conserved noncoding DNA elements，CNEs)矮小同源盒基因(SHOX基因)隨著后基因組學(功能基因組學)的到來，脊椎動物基因組的非編碼DNA序列的功能鑒定與特征研究已成為后基因時代的挑戰與研究熱點。隨著實驗技術的進步和發展，這些過去被當作是垃圾的CNEs，現在卻被認為具有重要的生物學功能。雖然CNEs不編碼蛋白質、rRNA、tRNA或ncRNA及與轉錄和翻譯相關的化學物質等，但有研究發現，CNEs在高級結構(染色質構型、蛋白的修飾等)、RNA的翻譯及加工過程和DNA轉錄水平等對基因的表達進行遠距離調控，并且還被證實與人類疾病和哺乳動物的各色各樣的外表形態有關。隨著對CNEs研究的逐步深入，發現大量疾病的發生是由于CNEs的改變，如孤獨癥、Rett綜合征及胰腺發育不全均被證實致病基因內部或側翼區的CNEs對其相關基因有調控作用。同樣在Leri–Weill軟骨發育異常、Langer肢中部發育不良和特發性矮小中均報道SHOX基因(矮身材含同源異型盒基因——short stature homeobox containing gene，SHOX)內部和(或)上、下游PAR1包括SHOX增強元件有突變或者缺失，說明CNEs對該基因有調控作用。