[發明專利]一種嗜中性粒細胞的富集分離方法

在審

• 申請號: 201810541880.1
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108676776A
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 董浚鍵;葉星;孫成飛;田園園;胡婕
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N5/0787
• 分類號: C12N5/0787;A01K61/10
• 代理公司: 佛山幫專知識產權代理事務所(普通合伙) 44387
• 代理人: 顏春艷

1.一種嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，具體過程如下：

1)用第一注射器向閉鰾類魚體的魚鰾內注射大腸桿菌滅活菌液后，繼續培養；

2)用第二注射器沿原注射孔向步驟1)所得閉鰾類魚體的魚鰾內注射HBSS，輕輕顛倒魚體；

3)用第三注射器從閉鰾類魚體的原注射孔中抽出嗜中性粒細胞懸液。

2.根據權利要求1所述的嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，所述步驟1)中，閉鰾類魚體在注射前經過室內養殖觀察以排除魚體攜帶病原的可能，所述室內養殖的條件如下：隔天換水約1/3，溶氧保持在5.0mg/L以上，pH 7.0～8.0，水溫30±2℃，每天投喂飼料兩次，每次投喂飼料質量約為魚體質量的3％。

3.根據權利要求1所述的嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，所述步驟1)中，大腸桿菌滅活菌液的配制過程如下：

A)大腸桿菌菌種解凍并培養，長出菌落后挑取單菌落培養至穩定期；

B)培養的菌液離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體；

C)重懸菌液再次離心收集菌體，加入2mg/mL福爾馬林重懸菌體滅活，滅活時間為18-24小時；

D)滅活菌液離心收集菌體并稱重；菌體用HBSS懸浮，濃度控制為5mg/mL。

4.根據權利要求3所述的嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，所述步驟1)中，大腸桿菌滅活菌液的配制過程如下：

A)凍存保存的大腸桿菌菌種常溫解凍并在固體培養基上劃線培養，長出菌落后挑取單菌落置于液體培養基培養至穩定期；

B)培養的菌液置于冷凍離心機在≥4000r/min 4℃條件下離心10分鐘，去除上清，收集菌體，用50-100mL預冷的PBS緩沖液洗滌菌體；

C)重懸菌液再次于冷凍離心機在4000r/min 4℃離心10分鐘，去除上清，收集菌體，加入20-50mL福爾馬林重懸菌體滅活18-24小時；

D)滅活菌液置于冷凍離心機在≥4000r/min 4℃條件下離心10分鐘，去除上清，收集菌體并稱重；菌體用HBSS懸浮，濃度控制為5mg/mL。

5.根據權利要求1所述的嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，所述第一注射器為1mL一次性注射器；

所述大腸桿菌滅活菌液的注射量為每50g魚體注射0.2mL。

6.根據權利要求1所述的嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，所述閉鰾類魚體為羅非魚；所述步驟1)中注射的位置為羅非魚側線鱗上一排鱗片的第二個鱗片。

7.根據權利要求1所述的嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，所述原注射孔是指步驟1)中第一注射器注射后在魚體上留下的孔。

8.根據權利要求1所述的嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，所述步驟1)中繼續培養的條件如下:注射后的魚放回25-30℃水溫的魚缸繼續培養12-24小時。

9.根據權利要求1所述的嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，所述第二注射器為5mL一次性注射器；

所述HBSS的注射量為0.8-2mL；所述HBSS是指100單位/mL HBSS中加入肝素的HBSS溶液；

所述步驟2)中輕輕顛倒魚體的次數約2～10次。

10.根據權利要求1所述的嗜中性粒細胞的富集分離方法，其特征在于，所述第三注射器為裝有50mL切平的注射器針頭的5mL注射器。