[發(fā)明專利]一種毛囊干細(xì)胞儲(chǔ)存液及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810541479.8
• 申請(qǐng)日: 2018-05-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108795854A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐智峰;張新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州沙艾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 北京華識(shí)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11530
• 代理人: 劉艷玲

1.一種毛囊干細(xì)胞儲(chǔ)存液，其特征在于，所述儲(chǔ)存液包括DMEM/F12、NaHC0₃、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)、氫化可的松、胎牛血清(FBS)，頭孢菌素，腺嘌呤、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；所述儲(chǔ)存液中以DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，DMEM培養(yǎng)液與F12培養(yǎng)液的比例為3-6:1，NaHC0₃的濃度為3mg/mL～10mg/mL，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的濃度為5ng/mL～20ng/mL，類胰島素生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)的濃度為15ng/mL～50ng/mL，氫化可的松的濃度為200ng/L～300ng/L，胎牛血清的體積百分比為1％-10％，頭孢菌素的濃度為20ng/mL～50ng/mL，腺嘌呤的濃度為30μg/mL～80μg/mL，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為8ng/mL～20ng/mL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛囊干細(xì)胞儲(chǔ)存液，其特征在于，所述DMEM培養(yǎng)液與F12培養(yǎng)液的比例為3-5:1，NaHC0₃的濃度為3mg/mL～8mg/mL，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的濃度為5ng/mL～15ng/mL，類胰島素生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)的濃度為15ng/mL～30ng/mL，氫化可的松的濃度為200ng/L～250ng/L，胎牛血清的體積百分比為1％-6％，頭孢菌素的濃度為20ng/mL～40ng/mL，腺嘌呤的濃度為30μg/mL～60μg/mL，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為8ng/mL～15ng/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛囊干細(xì)胞儲(chǔ)存液，其特征在于，所述DMEM培養(yǎng)液與F12培養(yǎng)液的比例為3:1，NaHC0₃的濃度為5mg/mL，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的濃度為10ng/mL，類胰島素生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)的濃度為20ng/mL，氫化可的松的濃度為220ng/L，胎牛血清的體積百分比為5％，頭孢菌素的濃度為30ng/mL，腺嘌呤的濃度為50μg/mL，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為10ng/mL。

4.一種利用權(quán)利要求1所述的儲(chǔ)存液培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1在無(wú)菌環(huán)境下，將分離得到的毛囊用PBS沖洗3-5次，均勻涂布于培養(yǎng)皿中，使用移液器緩慢滴加0.2％的蛋白酶K至剛剛沒(méi)過(guò)游離的毛囊，并將培養(yǎng)皿蓋好置于37℃，80rpm的搖床中，孵育5-20min；

S2.利用移液器將殘留的消化液吸出，立刻加入少量的權(quán)利要求1的儲(chǔ)存液，至浸潤(rùn)狀態(tài)，置于37℃，70rpm的搖床中，孵育60-120min，促進(jìn)細(xì)胞貼壁；

S3.待細(xì)胞貼壁后，再加入少量?jī)?chǔ)存液，置于37℃，CO2濃度含量為5％，濕度為60-80％的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄細(xì)胞分離生長(zhǎng)情況；

S4.待毛囊周圍遷移出大量上皮樣細(xì)胞后，更換為每孔3mL工作培養(yǎng)液，放入37℃，5％C02，濕度為60-80％的培養(yǎng)箱中啟動(dòng)ORSC原代培養(yǎng)；

S5.倒置顯微鏡下觀察，游離出的毛囊外根鞘細(xì)胞(ORSC)生長(zhǎng)成單層后，消化移入培養(yǎng)瓶中使用工作培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，2～3天更換一次工作培養(yǎng)液培養(yǎng)液。