[發明專利]一種醫用細胞修復劑的制備方法

有效

• 申請號: 201810540720.5
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108685948B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 馬步鵬;李棟;宋蕓娟
• 申請（專利權）人: 北京壹典壹生生物技術有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K38/18;A61P17/02;C12N5/0775;A61K31/734;A61K31/728;A61K31/43;A61K31/7036
• 代理公司: 北京華際知識產權代理有限公司 11676
• 代理人: 楊覓

本發明涉及修復創傷的藥劑，尤其是涉及一種醫用細胞修復劑的制備方法。具體的制備步驟為，人羊膜間充質干細胞的分離純化和培養，海藻酸鈉復合劑的制備，細胞修復劑的制備。本發明建立了人羊膜間充質干細胞制備方法和相應的干細胞庫，為較大規模生產制備人羊膜間充質干細胞修復劑及其應用做好了準備。

技術領域：

本發明涉及修復創傷的藥劑，尤其是涉及一種醫用細胞修復劑的制備方法。

背景技術：

皮膚創傷修復是一個復雜的生物學過程，它啟動一系列復雜的生物學事件,包括炎癥、組織新生及組織重構。雖然許多研究采用不同的方法治療皮膚創傷修復，但愈合質量低、附屬器官不可再生等依然是皮膚創傷愈合過程中的關鍵問題。目前，皮膚移植是修復大面積皮膚損傷的最有效方法。近年來，人工合成皮膚已經被用來治療皮膚損傷，但并不是一種完美的皮膚替代物，也存在著一系列的問題：目前使用的人工合成皮膚種子細胞是自體或異體的表皮細胞。自體表皮細胞數量不足，異體表皮細胞則存在著排異反應；目前使用的人工合成皮膚中存在著活細胞，但是保存是個問題，若臨時制備需要時間較長，而皮膚損傷需要在盡快的時間內使用人工合成皮膚；目前使用的人工合成皮膚不具有創面新生皮形成血管的能力，容易壞死。而間充質干細胞已經被證實是皮膚創傷修復的有效種子細胞。

已有諸多實驗研究結果證實BMSCs在促進創面愈合方面起到積極的作用。Badiavas將骨髓間充質干細胞移植到深II度燒傷創面,發現其明顯促進創面的愈合。付小兵等將BMSCs移植至豬深度燒傷創面，發現創面愈合速度明顯加快，表皮增厚，真皮神經纖維增多，大大改善了創面愈合質量。文獻報道BMSCs還參與表皮、汗腺及創面血管的重建。這些研究結果表明BMSCs是非常好的皮膚組織工程種子細胞。創傷愈合的各個階段都有生長因子的參與和調控，生長因子對治療慢性難愈合皮膚創口和大面積燒傷創面有著廣闊的應用前景。但是作為臨床應用，獲得骨髓間充質干細胞時手續比較復雜，提供者比較痛苦。此外，骨髓來源的間充質干細胞是隨著提供者年齡的增加，其數量會減少，相應的分化能力也會變弱。近年來，發現胎盤附屬組織來源的干細胞，尤其是羊膜間充質干細胞，是骨髓間充質干細胞很好的替代品。2004年，IntAnker等從羊膜培養出的人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)，其免疫表型與骨髓間充質干細胞(BMSCs)相似，且其比BMSCs具有更強的擴增能力。hAMSCs不但具有干細胞特征，而且表現出低免疫源性和免疫抑制作用，是較為理想的免疫赦免細胞，是皮膚創傷修復的有效種子細胞。它不僅更原始，生長能力強，而且排異反應也較小。羊膜組織本是醫療廢棄物，來源廣泛而且易得。

申請號為200810136415.6的發明專利公開了一種使用甲基纖維素作為細胞基質的人臍帶間充質干細胞創面涂抹劑的制備方法，但是該發明含有抗生素慶大霉素，不適用于抗生素過敏人群；人臍帶間充干細胞的使用沒有配型，可能會有排異反應，而且涂抹劑快速配制中含有動物源成分胎牛血清，有可能造成過敏以及具有動物源性安全隱患。

發明內容：

本發明正是針對上述問題，提供了一種醫用細胞修復劑的制備方法。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案，具體的制備步驟為，

1、海藻酸鈉復合劑的制備

稱取5g無水海藻酸鈉，加入到100ml玻璃瓶中，接著加入40ml去離子水均勻攪拌至溶解，再加入20ml甘油混勻，然后加入40ml的無血清間充質干細胞培養基充分混勻；再往玻璃瓶中添加表皮生長因子EGF 1mg、堿性成纖維細胞生長因子bFGF 2mg、血管生長因子VEGF2mg，攪拌均勻后得到海藻酸鈉復合劑；

2、細胞修復劑的制備

向1ml步驟1制得的海藻糖復合劑中加入1.0×10⁶細胞/ml人羊膜間充質干細胞懸液1ml，再加入1ml質量濃度為1％的透明質酸鈉液，攪拌均勻后即得細胞修復劑。

人羊膜間充質干細胞的制備步驟為，

(1)分離純化