[發明專利]一種SKA3基因干擾慢病毒載體及其制備方法

在審

• 申請號: 201810532427.4
• 申請日: 2018-05-29
• 公開（公告）號: CN108728493A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 吳勇延;高偉;張璐;張宇良;洛鴻潔;李文奇;王斌全;張春明;溫樹信;牛敏;鄭希望;崔佳佳;桑江瑋;吳中強;石勇;楊東麗;趙沁麗;薄云峰;李會政
• 申請（專利權）人: 山西醫科大學第一醫院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 太原申立德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

1.一種SKA3基因干擾慢病毒載體，其特征是：所述的載體為人源U6啟動子轉錄的靶向人SKA3基因的shRNA模板序列。

2.根據權利要求1所述的SKA3基因干擾慢病毒載體，其特征是：所述人源U6啟動子的序列如SEQ.ID.NO.4所示。

3.根據權利要求1所述的SKA3基因干擾慢病毒載體，其特征是：所述靶向人SKA3基因的shRNA模板序列包括三條，即shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3，其中shRNA-1基因序列如SEQ.ID.NO.1所示；shRNA-2的基因序列如SEQ.ID.NO.2所示；shRNA-3基因序列如SEQ.ID.NO.3所示。

4.權利要求1-3中任一項所述的SKA3基因干擾慢病毒載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

A1：依次用Age I和EcoR I酶切PLKO.1 puro骨架載體質粒，凝膠電泳回收酶切的PLKO.1puro骨架載體質粒，將靶向人SKA3基因的3條不同shRNA模板DNA序列shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3分別與凝膠電泳回收的PLKO.1 puro骨架載體質粒連接，獲得3個連接產物，取三個含有100μL的DH5α感受態菌液容器，每個容器中加入一種連接產物25μL，混勻，冰浴25分鐘；

A2：取步驟A1冰浴后的三種菌液分別置于相應的離心管中，熱激90s，之后迅速冰浴3分鐘，再向每個離心管中加入LB液體培養基至1mL,在37℃培養箱中復蘇60分鐘完成轉化，獲得三種轉化的菌液；

A3：取三個含100ug/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板，在每個LB瓊脂板中加入一種轉化的菌液100uL，用涂布棒涂布均勻，37℃倒置培養過夜；

A4：從三個過夜培養的LB瓊脂板上挑取單克隆菌，擴大培養后提取質粒，質粒進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性質粒，陽性質粒電泳條帶明顯滯后于PLKO.1 puro骨架載體質粒；

A5：陽性質粒通過DNA測序驗證序列是否正確，序列與預期完全一致的陽性質粒為目的載體質粒，3條不同shRNA模板序列構建的目的載體質粒分別命名為pLKO.1-shSKA3-1,pLKO.1-shSKA3-2和pLKO.1-shSKA3-3。

5.根據權利要求4所述的SKA3基因干擾慢病毒載體的制備方法，其特征在于，步驟A1所述shRNA模板DNA序列需變性退火處理，變性退火處理的方法是使用PCR儀95℃孵育4min，70℃孵育10min，隨后緩慢冷卻至室溫。

6.根據權利要求4所述的SKA3基因干擾慢病毒載體的制備方法，其特征在于，所述目的載體質粒pLKO.1-shSKA3-1,pLKO.1-shSKA3-2和pLKO.1-shSKA3-3轉染Hep2細胞，利用Real-time PCR檢測SKA3基因的敲降效率。