[發明專利]由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法

在審

• 申請號: 201810526455.5
• 申請日: 2018-05-29
• 公開（公告）號: CN108676810A
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 胡志宏;曾斌;孫云龍;牛亞麗
• 申請（專利權）人: 江西科技師范大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/65;C12N1/15;C12R1/69
• 代理公司: 南昌大牛專利代理事務所(普通合伙) 36135
• 代理人: 喻莎

1.由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1)以pPTRⅠ載體為模板，以序列為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的DNA片段為引物執行PCR擴增，得到ptrA表達盒；通過酶切位點EcoRⅠ和SpeⅠ將pEX1載體雙酶切，將酶切產物與所述ptrA表達盒連接，得到pEX1-ptrA載體；將所述pEX1-ptrA載體轉化至感受態的農桿菌AGL1株；

2)將米曲霉3.042株的孢子接種于PDA或者DPY培養基培養3天，收集孢子；將收集物過濾后以4000rpm的轉速離心10min，再用蒸餾水洗滌2次，得到孢子與水的混合物，調整其中孢子濃度至10⁶個/mL，即得到孢子懸液；

3)將步驟1)轉化后的農桿菌AGL1株接種至10mL同時具有卡那霉素抗性和利福平抗性的LB培養基中，以28℃的溫度、200rpm的轉速搖瓶培養；取1mL該培養液與9mL IM液體培養基混合，而后以28℃的溫度、200rpm的轉速搖瓶培養6h，得到菌液；

4)取100μL步驟3)所得菌液和100μL步驟2)所得孢子懸液，共涂布到鋪有玻璃紙的IM固體培養基上，于22℃、避光培養48h；

5)將玻璃紙取出，覆蓋到同時含有300μg/mL頭孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培養基上，30℃培養5～7d；挑取長出的菌落，接種至另一新鮮的、同時含有300μg/mL頭孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培養基上，培養，長出的菌落即為陽性轉化子。

2.根據權利要求1所述的由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法，其特征在于還包括以下步驟6)：取步驟5)所得的陽性轉化子，提取其DNA，使用GFP特異性引物通過PCR驗證其是否為陽性轉化子，同時利用熒光顯微鏡觀察GFP。

3.根據權利要求1所述的由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法，其特征在于步驟1)中所述ptrA表達盒的長度為2000bp。

4.根據權利要求1所述的由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法，其特征在于步驟1)中酶切產物與ptrA表達盒是通過infusion方式進行連接的。

5.根據權利要求1所述的由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法，其特征在于步驟3)所述IM液體培養基是通過以下方法配制的：40mM MES，5mM葡萄糖，0.5％(w/v)甘油和200μM乙酰丁香酮溶于MM鹽溶液。

6.根據權利要求5所述的由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法，其特征在于每1L所述MM鹽溶液含有以下成分：K₂HPO₄ 2.05g，KH₂PO₄ 1.45g，NaCl0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂·6H₂O 0.1g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.0025g。

7.根據權利要求1所述的由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法，其特征在于步驟3)中，所述1mL該培養液與9mL IM液體培養基混合之后，其OD₆₀₀值為0.2～0.3。

8.根據權利要求1所述的由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法，其特征在于步驟3)中，所述搖瓶培養6h之后，其中OD₆₀₀值為0.6～0.8。

9.根據權利要求2所述的由農桿菌介導以吡啶硫胺素為篩選標記的米曲霉轉基因體系構建方法，其特征在于步驟6)中，所述GFP特異性引物的序列分別如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4所示。