[發(fā)明專(zhuān)利]斑馬魚(yú)notch2基因突變體的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810526041.2
• 申請(qǐng)日: 2018-05-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108707628B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張慶華;岳倩文;徐行;季策;李偉明
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/90
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/90;C12N9/22;A01K67/027
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

本發(fā)明公開(kāi)了涉及一種斑馬魚(yú)notch2基因突變體的制備方法；包括如下步驟：確定notch2基因敲除的靶點(diǎn)位置；以pUC19?gRNA scaffold質(zhì)粒為模板，使用引物T7?notch2?sfd、tracr rev進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對(duì)PCR產(chǎn)物純化、體外轉(zhuǎn)錄獲得gRNA；將gRNA與Cas9蛋白顯微注射入斑馬魚(yú)胚胎一細(xì)胞期中，篩選獲得穩(wěn)定遺傳的notch2基因突變體。本發(fā)明利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過(guò)選擇獨(dú)特的一段打靶區(qū)，使得斑馬魚(yú)中的notch2基因被敲除，又不“誤傷”其他基因，形成Notch2敲除的斑馬魚(yú)，為后續(xù)基因功能的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)于研究Notch信號(hào)通路意義重大。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種斑馬魚(yú)突變體，具體涉及一種斑馬魚(yú)notch2基因突變體的制備方法。

背景技術(shù)

CRISPR/Cas系統(tǒng)最早是在細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其主要功能是對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大學(xué)(Osaka University)的研究人員在Escherichiacoli K12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)和CRISPR相關(guān)基因(CRISPR-associated genes，Cas gene)，目前普遍認(rèn)為有40％的細(xì)菌基因組具有這樣的結(jié)構(gòu)。CRISPR技術(shù)是最新出現(xiàn)的第三代基因組編輯工具，它能夠完成RNA導(dǎo)向的DNA識(shí)別及編輯。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)源于一種微生物防御噬菌體DNA或外源質(zhì)粒入侵的后天免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)的防御機(jī)制可以分為三個(gè)階段。第一個(gè)階段稱(chēng)為間隔序列的獲得，間隔序列被識(shí)別并被整合到CRISPR基因座中兩個(gè)相鄰重復(fù)單元之間。第二階段被稱(chēng)為CRISPR的表達(dá)，一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄本，被RNA聚合酶從CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄而來(lái)。隨后，特異性的核酸內(nèi)切酶將pre-crRNAs切割成小的CRISPR RNAs(crRNAs)。第三個(gè)階段稱(chēng)為干擾或免疫，在crRNA和Cas蛋白形成的復(fù)合物中crRNA能識(shí)別堿基對(duì)，特別是具有完全(或幾乎完全)互補(bǔ)的外來(lái)DNA(或RNA)的區(qū)域。這樣便開(kāi)始了Cas蛋白對(duì)特定位點(diǎn)的切割。從細(xì)菌到古細(xì)菌共有三種類(lèi)型的CRISPR/Cas系統(tǒng)，分別是Type I、II、III，其中Type II的運(yùn)用最多。Type II中包括標(biāo)志性的Cas9蛋白，該蛋白主要促進(jìn)crRNA的成熟，降解侵入的噬菌體DNA或者入侵的外源質(zhì)粒。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已廣泛用于小鼠、斑馬魚(yú)、果蠅、酵母、大米、小麥、細(xì)菌等各種生物上，實(shí)現(xiàn)了不同生物進(jìn)化階段物種的基因編輯。

與鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)有如下優(yōu)勢(shì)：

1、Cas9不具有特異性；

2、gRNA體現(xiàn)需要敲除的基因的特異性，靶向精確，作用高效，脫靶率低；

3、廉價(jià)便捷，細(xì)胞毒性低；

4、CRISPR技術(shù)更易于操作，具有更強(qiáng)的可擴(kuò)展性。

在人中NOTCH2受體突變會(huì)造成Alagille綜合征，又稱(chēng)先天性肝內(nèi)膽管發(fā)育不良征，是一種類(lèi)及多系統(tǒng)的顯性遺傳性疾病，涉及的臟器包括肝臟、心臟、骨骼、眼睛和顏面等，肝內(nèi)膽汁淤積為主要特征。面部特征主要為前額突出，眼與鼻的距離大，下頦小而尖等。目前無(wú)特殊療法，可給予消膽胺或中藥，以治療膽汁淤積，并補(bǔ)充脂溶性纖維素。

在小鼠中，Notch2突變后可造成眼睛缺陷，表現(xiàn)為眼睛變小，明顯的晶狀體后的增生，形成異常的球狀結(jié)構(gòu)，眼睛不對(duì)稱(chēng)；造成心臟和血管受損，具體為心臟生長(zhǎng)遲緩、心包水腫和出血，心肌壁變薄、心肌小梁降低；造成腎小球發(fā)育缺陷，腎臟發(fā)育緩慢。突變體小鼠最終在E16.5之前死亡。