[發明專利]LRR受體激酶-PXY的純化方法

有效

• 申請號: 201810525064.1
• 申請日: 2018-05-28
• 公開（公告）號: CN108753753B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 張建國;國鵬;王兆山
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院林業研究所
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/70
• 代理公司: 北京久遠信知識產權代理有限公司 16061
• 代理人: 王海燕

1.一種LRR受體激酶-PXY的純化方法，其特征在于，包括：

S1：獲得表達PXY的重組菌，誘導表達PXY；

S2：破碎經誘導表達PXY后的重組菌，分離得到含有包涵體的第一沉淀物；

S3：用包涵體洗滌液重懸所述第一沉淀物并離心，得到第一含有PXY的包涵體；

S4：將所述第一含有PXY的包涵體用第一包涵體溶解液進行孵育，分離得到第二含有PXY的包涵體；和

S5：將所述第二含有PXY的包涵體用第二包涵體溶解液進行孵育，分離得到PXY膜蛋白；

所述步驟S4中所述第一包涵體溶解液包含20mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM K2HPO4，100mM NaCl，12.6％甘油，5mMβ-巰基乙醇，1.5％十二烷基-β-D-麥芽糖苷；和/或

所述步驟S4中所述孵育為在4℃條件下過夜震蕩孵育；和/或

所述步驟S4中所述離心的轉速為10000g-14000g，離心的時間為5min-15min；和/或

所述步驟S5中所述第二包涵體溶解液包含20mM Tris-HCl,pH 7.5，20mM K2HPO4，100mM NaCl，12.6％甘油，5mMβ-巰基乙醇，1.5％十二烷基-β-D-麥芽糖苷；和/或

所述步驟S5中所述孵育為在4℃條件下過夜震蕩孵育；和/或

所述步驟S5中所述離心的轉速為10000g-14000g，離心的時間為5min-15min。

2.根據權利要求1所述的LRR受體激酶-PXY的純化方法，其特征在于，所述步驟S4和S5中的振蕩頻率為16-20rpm。

3.根據權利要求1所述的LRR受體激酶-PXY的純化方法，其特征在于，所述步驟S1中所述獲得表達PXY的重組菌的具體操作方法為：

擴增基因片段：選取擬南芥PXY基因，根據所述PXY基因設計引物對，利用所述引物對擴增所述PXY基因；

構建重組質粒：選用質粒pHUE作為轉化載體，酶切所述質粒pHUE和所述已擴增的PXY基因，再利用連接酶將所述酶切后的質粒pHUE和所述酶切后的PXY基因片段連接，得到重組質粒；和

構建表達PXY的重組菌：將所述重組質粒轉化入感受態大腸桿菌，得到表達PXY的重組菌。

4.根據權利要求3所述的LRR受體激酶-PXY的純化方法，其特征在于，所述步驟擴增基因片段步驟中，所述引物對包括上游引物F'5'-CTCCGCGGTGGACTCAAGTTTTCACCTCAACTC-3'和下游引物R'5'-GGGGTACCTCACACCCCAATCCTTTGAC-3'；所述上游引物引入酶切位點SacII，所述下游引物引入酶切位點KpnI；和/或

所述擴增基因片段步驟中采用的PCR反應體系為50μl，其中包含2μl的PXY基因cDNA模板、1μl的所述上游引物、1μl的所述下游引物、25μl的DNA聚合酶，21μl的去離子水；其中所述PCR反應采用的擴增條件為：在98℃下預變性4min，在98℃下變性10s，在50℃～60℃下退火15s，在72℃下延伸30s，共30個循環，然后在72℃下延伸10min，然后在4℃下保溫；和/或

所述構建重組質粒步驟中，所述酶切采用內切酶SacII和內切酶KpnI分別同時酶切所述已擴增的PXY基因和所述質粒pHUE；和/或

所述構建重組質粒步驟中，所述連接酶為T7連接酶；和/或

所述構建表達PXY的重組菌步驟中，所述感受態大腸桿菌為BL21(DE3)。

5.根據權利要求1-3中任一項所述的LRR受體激酶-PXY的純化方法，其特征在于，所述步驟S1中所述誘導表達PXY之前還包括：

篩選表達PXY的重組菌陽性菌落：將所述表達PXY的重組菌接種在氨芐青霉素LB培養基上，篩選獲得表達PXY的重組菌陽性菌落。